Окраска по Романовскому-Гимзе.Краситель состоит из щелочной части (азур II - ярко-синий цвет), и кислой части (эозин - розово-красный цвет).

В настоящее время используется готовый краситель Романовского-Гимзе, из которого перед началом работы готовят рабочий раствор из расчета 1 капля краски на 1 млдистиллированной воды.

Высохший фиксированный мазок помещается в кювету с рабочим раствором краски на 25-40 минут (конкретное время устанавливается опытным путем для каждой партии красителя).Бактерии окрашиваются в фиолетово-красный цвет, цитоплазма клеток – в голубой, ядра –в красный. При окрашивании простейших их цитоплазма приобретает голубой цвет, а ядра – красно-фиолетовый.Результаты окрашивания мазков крови:

• Ядра клеток – красно-фиолетовые.

• Эозинофильные гранулы – красновато-коричневые.

• Базофильные гранулы – синие.

• Нейтрофильные гранулы – фиолетовые.

• Цитоплазма лимфоцитов – голубая.

• Эритроциты – бледно-красные.

• Тромбоциты – наружная часть синяя (более светлая); внутренняя – фиолетовая (более темная).

Окраска по Маю-Грюнвальду.Данный метод очень удобен для визуализации гранулоцитов.Для окрашивания применяется готовый раствор эозин-метиленового синего по Маю-Грюнвальду. Мазок без предварительной фиксации заливают красителем, через 5 минут промывают и высушивают.

• Лимфоциты– ядра: сине-фиолетовые; цитоплазма: голубая.

• Моноциты– ядра: сине-фиолетовые; цитоплазма: серо-голубая.

• Гранулоциты – ядра: сине-фиолетовые; гранулы: красные, фиолетовые, темно-синие (зависит от типа).

• Тромбоциты– наружная часть голубая; внутренняя – фиолетовая.

• Эритроциты– розовые.

Окраска по Паппенгейму. Представляет собой комбинацию двух предыдущих методов.Сухие нефиксированные мазки помещаются в кювету с раствором Мая-Грюнвальда на 3 – 5минут. После этого контейнер с мазками ополаскивается дистиллированной водой, после чего мазки помещаются в кювету с разведенным раствором Романовского-Гимзы на 20 – 30минут. После этого мазки промываются проточной водой и высушиваются.

• Ядра клеток – красно-фиолетовые.

• Цитоплазма лимфоидных клеток – светло-синяя.

• Лимфоидная азурная грануляция – ярко-синяя.

• Миелоидная азурная грануляция – фиолетовая.

• Нейтрофильные гранулы – светло-фиолетовые.

• Эозинофильные гранулы – красные, красно-коричневые.

• Базофильные гранулы – темно-фиолетовые, черные.

• Эритроциты – розовые (полихроматофильные эритроциты - синеватые).

• ТельцаЖолли – красновато-фиолетовые.

• Тельца Ауэра – ярко-красные.

Методика окраски по Лейшману.Высушенные на воздухе препараты заливают краской Лейшмана на 3 мин., при этом препарат одновременно фиксируется. После этого промывают водопроводной водой и заливают азур - эозиновой смесью (40 мл 0, 1% азура II и 30 мл 0,1% эозина К) на 15 – 20 мин. Затем промывают водопроводной водой, высушивают на воздухе и микроскопируют. используется для выявления малярийных плазмодиев.

Экспресс – методы окраски цитологических препаратов.

Окраски по Алексееву. Ответ дается уже через 5– 10 минут. Метод Алексеева предусматривает ускоренную обработку цитологических препаратов азурэозиновыми смесями по принципу Романовского с целью получения привычной цитологической картины.Методика приготовления препаратов.

Обработка препаратов может производиться двумя способами:

1. Предметные стекла с высохшими на воздухе препаратами в количестве 3 – 5штук, укладывают на полочку для окраски отпечатками или мазками кверху. Глазной пипеткой на каждый препарат наносят раствор краски Романовского–Гимзы в количестве 5 – 8капель. Краска должна покрыть весь мазок или отпечаток. В таком состоянии препарат оставляют на 60 секунд, в течение которых он фиксируется метанолом, входящим в состав краски, и частично окрашиваются его элементы. Затем к краске на предметных стеклах добавляют 10 – 16 капель нейтральной дистиллированной воды, нагретой до 50 – 60° и покачиванием смешивают краску с водой. Препарат оставляют на l– 2минуты. Затем струей нейтральной дистиллированной воды из колбы-промывалки, не сливая, омывают краску с препарата. Остаток воды сливают и препарат просушиваютфильтровальной бумагой. Окрашенный препарат просматривают под микроскопом сначала с малым увеличением, а при нахождении подозрительных мест переходят на иммерсионный объектив. Остальные мазки оставляют залитыми краской на 3 – 5минут на тот случай, если первый препарат окажется бледно окрашенным. Первым обычно красится самый тонкий из препаратов, так как он быстрее пропитывается и сушится.

Окраска по этому методу тканевых и опухолевых клеток и лейкоцитов почти не отличается от окраски их в препаратах, обрабатываемых обычными цитологическими методами. При этом четко выделяется структура ядер, хорошо видны нуклеолы, зернистость и включения протоплазмы. Эритроциты частично гемолизируются, что облегчает исследование.

2. Приготовляют 0,4% раствор сухой краски Лейшмана в метаноле (метиловый спирт). Для ускорения растворения краски ее можно в закрытом флаконе поместить в водяную  баню при 60° на 1 час, помешивая. При охлаждении краску следует профильтровать. Раствор стоек. Препараты укладывают на полочку для окраски, покрывают нетолстым слоем раствора краски Лейшмана (12 – 15 капель на каждый препарат) и оставляют их на 20 – 30 секунд. Затем, не сливая краски Лейшмана со стекла, добавляют к ней раствор краски Романовского–Гимзына нейтральной дистиллированной воде (1,6 капли на 1 мл воды), нагретый до 50 – 60°, в количестве, способном удержаться на стекле. Первый препарат смывают через 2 – 3 минуты, остальные – докрашивают. Препарат высушивают фильтровальной бумагой и исследуют под микроскопом. Микроскопическая картина при этом способе окраски более яркая, чем при первом. Эритроциты сохраняются. Особенно четко выступают темные нуклеолы на нежно окрашенных ядрах. Дистиллированная вода для разведения краски и смывания ее с препаратов должна иметь рН 6,8 – 7,0.

Окраски по Папаниколау. Метод окрашивания по Папаниколау являетсянаилучшим для гинекологических мазков, так как этот метод полихромный, он позволяет оценить степень созревания цитоплазмы (от сине-зеленого цвета в незрелых клетках до розового в клетках со зрелой цитоплазмой и оранжевого в клетках с ороговением), благодаря влажной фиксации хорошо сохраняются ядра, клеточная мембрана и структура хроматина. Ответ дается через 15– 20 минут.

Необходимые реактивы:

1. Смесь Никифорова.

2. Спирт 95, 90, 80, 70 и 50°.

3. Гематоксилин Гарриса.

4. 0,25%-ный раствор соляной кислоты.

5. Краска оранжевая Г.

6. Краска (ЕА-36).

7. Абсолютный спирт.

8. Ксилол.

9. Канадский бальзам.

Приготовление гематоксилина Гарриса:

1 г гематоксилина растворяют в 10 мл абсолютного спирта, 20 г калийных квацов растворяют при нагревании в 200 мл дистиллированной воды. Через 24 ч оба раствора соединяют и прибавляют 0,5 г красной или желтой окиси ртути. Раствор нагревают до кипения, остужают и через 24 ч фильтруют.

Приготовление раствора краски оранжевая Г:

К 100 мл 0,5%-ного спиртового раствора оранжевой краски Г добавляют 0,015 г фосфорно-вольфрамовой кислоты.

Приготовление составной краски (ЕА-36):

45 мл 0,5%-ного спиртового раствора светлой зеленой, 10 мл 0,5%-ного спиртового раствора бисмаркбраун, 45 мл 0,5%-ного спиртового раствора эозина желтоватого (водо- и спирторастворимого), 0,2 г фосфорновольфрамовой кислоты, капля насыщенного водного раствора углекислого лития.

Ход окраски:

Мазки после фиксации проводят последовательно через сосуды, содержащие 80, 70 и 50° спирты и дистиллированную воду. Затем 6 мин гематоксилином Гарриса, осторожно споласкивают дистиллированной водой и погружают (6 раз) в 0,25%-ный раствор соляной кислоты. Далее на 6 минут кладут в сосуд с проточной водопроводной водой и обмывают дистиллированной водой. Затем проводят через 50, 70, 80 и 95° спирты. Обезвоженные таким образом препараты окрашивают в течение 1,5 мин краской оранжевой Г, споласкивают в двух сменах 95° спирта и красят в течение 1,5 мин составной краской (ЕА-36). Мазки отмывают от избытка краски в трех сменах 95° спирта. Далее препараты просветляют проведением через абсолютный спирт, через смесь абсолютного спирта и ксилола в равных объемах и, наконец, через ксилол, после чего заключают в канадский бальзам.

К полихромным методам окраски так же относят метод Шорра (или его модификациюМ. Г. Арсеньевой (1963) и др.), позволяющий дифференцировать клетки на эозинофильные (красные) и базофильные (синие), и монохромные методы (окраска гематоксилином и эозином или гематоксилином и фуксином).Фиксация препарата производилась в метиловом спирте (15 минут). Окрашивание препаратов производилось гематоксилином-эозином. Фиксированные мазки окрашивались водным раствором гематоксилина до получения бледно-фиолетового окрашивания (7 – 10 минут). После промывания проточной водой мазки вновь окрашивались 1%-ным водным раствором эозина в течение 0,5 мин, промывались проточной водой и высушивались.При   полихромном   методе   поверхностные   клетки   окрашиваются в красный или сине-зеленый цвет, промежуточные и парабазальные – в сине-зеленый, базальные – в темно-синий.

Цитохимические методы основаны на специфической химической цветной реакции между химическим реактивом и определённым компонентом клетки для определения в клетках различных веществ (под действием специально подобранных реактивов происходит окрашивание тех или иных веществ в цитоплазме, а по степени и характеру окраски судят о количестве или активности исследуемых веществ).

При цитохимическом исследовании чаще пользуются полуколичественной оценкой результатов, используя принцип Астальди, основанный на выявлении различной степени интенсивности специфической окраски (средний цитохимический коэффициент - СЦК).

В зависимости от нее исследуемые элементы делят на 4 группы: с отрицательной реакцией (-), слабоположительной (+), положительной (++) и резко положительной (+++). Для количественного выражения результатов подсчитывают 100 клеток определенного вида, дифференцируя их по указанному принципу, затем число клеток с одинаковой интенсивностью окраски умножают на соответствующее данной группе число плюсов, сумма этих произведений составляет условные единицы.Например, при исследовании активности щелочной фосфатазы в нейтрофилах из 100 просмотренных клеток в 60 клетках активность фермента не выявлена (-), в 35 - специфическая окраска была слабой (+) и в 5 - более интенсивной (++). Результат определения активности щелочной фосфатазы в нейтрофилах в таком случае составит (60х0)+(35х1)+(5х2)/100=0+35+10/100=0,45 ед.

ШИК-реакция или PAS-реакция (для выявления гликогена).

Реактив - Шифф-периодная кислота (выделенные буквы и составляют аббревиатуру ШИК – шифф-йодная кислота). Под влиянием периодата калия гликоген окисляется с образованием альдегидных соединений, легко реагирующих с реактивом Шиффа (фуксин-сернистая кислота). В местах локализации гликогена выявляется вишнево-фиолетовое окрашивание, по интенсивности которого можно судить о количестве гликогена в клетках.

Кроме гликогена, положительную реакцию могут давать такие ШИК-положительные вещества, как кислые и нейтральные мукополисахариды, мукопротеины, гликопротеины и др. Гликоген легко дифференцировать от других веществ пробой со слюной или диастазой.

В мазках периферической крови гликоген содержится в цитоплазме нейтрофилов (в виде обильной мелкой зернистости), цитоплазме лимфоцитов (в виде небольшого количества крупных зерен) и тромбоцитах (в виде одиночных крупных зерен). В пунктате костного мозга гликоген выявляется в нейтрофилах разной степени зрелости, лимфоцитах и мегакариоцитах.

Обнаружение гликогена методом Мак-Мануса.

Метод Мак-Мануса выявляет вещества углеводной природы (гликозаминогликанов, гликопротеидов, гликогена и др.) в цитологических препаратах. Метод основывается на образовании диальдегидов, которые определяют с помощью реактива Шиффа под воздействием окислителя (йодной кислотой). В клеткахгликоген обнаруживается в виде вишнево-красных гранул.

Методы выявление ферментов: