31. Синхронизация полового цикла самок

По некоторым причинам (неправильное кормление, содержание, генетическая предрасположенность и др.) возможны сбои в половом цикле самки, что может привести к неправильному ведению племенной работы, а также к нерациональному использованию самки. Поэтому иногда необходима синхронизация и стимуляция полового цикла с помощью фармакологических препаратов. Синхронизацию стадии возбуждения полового цикла можно проводить только у здоровых животных и обязательно на фоне оптимального кормления и содержания. [3]

Для регуляции воспроизводительной функции применяют следующие препараты:

1)Гонадотропины плацентарного происхождения:

-фоллимаг

-фоллигон

-серпгон

-хориогонин

-хуролон

2)Гонадотропины гипофизарного происхождения:

-ФСГ - супер

-ФСГ - П

-фоллитропин

3)Гонадолиберины:

-сурфагон

-фертагил

-диригестран

-супергестран

4)Простагландины:

-динопрост

-динопростон

-энзапрост

-эстрофан

-магэстрофан

-просольвин

5)Прогестины:

-прогестерон

-диамол

Синхронизация полового цикла коровы

Задачи синхронизации охоты у КРС:

1. Осеменить большое количество животных в сжатые сроки. 2.Перенести период массовых отелов в молочном скотоводстве в экономических целях. 3. Получить туровый отел всего стада (мясное скотоводство). 4. Синхронизация эструса у животных в случаях, когда выявление половой охоты затруднено или невозможно, вследствие ряда производственных причин, а также для сокращения сервис - периода.

Технология синхронизации охоты это выполнение инъекций гормонов и проведение искусственного осеменения в строго отведенное время, вне зависимости от клинического проявления эструса у животных.

Подготовка коров к синхронизации:

1. Отбор животных 2. Клиническое обследование животных 3. Подготовка необходимых расходных материалов и оборудования.

Перед проведением синхронизации половой охоты следует понимать, кто и когда будет выполнять необходимые мероприятия. В случае сбоя в работе или не выполнения соответствующих процедур, а также попытки замены рекомендованных препаратов на аналоги эффективность может быть ниже, вплоть до совершенно нулевой. Отбор животных проводят, исходя из поставленных задач. Из коров и телок формируют отдельные группы. Обследование животных включает оценку физиологического состояния, клинические исследования, а также диагностику методом ректальной пальпации.

К любому способу синхронизации охоты не допускаются животные:

а) больные инфекционными заболеваниями (особенно ИРТ и ВД); б) не достигшие физиологической зрелости, согласно стандартам породы, а также чрезмерно истощенные или ожиревшие; в) находящиеся в состоянии отрицательного энергетического баланса, т.е. в периоде прогрессирующей потери массы тела после отела; г) болеющие любым видом эндометрита, д) имеющие зрелые фолликулярные и лютеиновые кисты, а также новообразования в органах размножения; е) болеющие или переболевшие двусторонним воспалением яйцеводов; ж) фримартины, т.е. те тёлочки, которые родились в двойне с бычком; з) стельные. Подготовка к синхронизации заключается в сборе необходимых препаратов и спермодоз, желательно с 20% запасом от расчетного; приборов, оборудования и материалов для оценки качества, хранения, оттаивания и введения спермы.

Существуют три основные схемы синхронизации, а остальные в той или иной степени являются модификациями [5].

I. Синхронизация простагландинами

Просольвин 2 мл в/м Просольвин 2 мл в/м 72 ч и.о.

v v ^{96 ч И.О}

1 11 дни

Этот вариант синхронизации наиболее популярен в России. Требования к животным: коровы и телки должны быть абсолютно здоровы с нормальным гормональным статусом и хорошо развитыми яичниками. Допускается применение схемы при наличии персистентного желтого тела. Прогнозируемая эффективность: 50 - 60 %II.

Синхронизация релизинг-гормонами и простагландином

Фертагил 2 мл в/м Просольвин 2 мл в/м Фертагил 2 мл в/м _16 ч И.О. и.о.

v v 50-60 ч v 24ч

1 7 дни

Программа Ovsynch широко известна за рубежом как эффективная, простая и относительно недорогая. Требования к животным: допускаются здоровые животные, а также с начальной стадией кист, гипофункции яичников и персистентного желтого тела. Данная схема значительно эффективнее синхронизации простагландинами, так как синхронизируется не только охота, но и овуляция.

III. Синхронизация прогестероном, простагландином и ГСЖК

Крестар 2 мл в/м Просольвин 2 мл в/м Фоллигон 500 ЕД в/м И.О.

v v v 56ч v

1 9 10 дни

установка импланта удаление импланта

Крестар, п/к Крестар, п/к

Данная схема является самой эффективной на сегодняшний день. Модификация данного способа используется при трансплантации эмбрионов у коров. Требования к животным: допускаются к синхронизации животные на любой стадии гипофункции яичников. Высокая эффективность при однократном осеменении позволяет резко повысить уровень оплодотворяемости коров и телок, у которых это невозможно достичь другими способами. Прогнозируемая эффективность: 70 - 90%

32 Оплодотворение яйцеклеток вне организма животного (in vitro

Разработка метода искусственного осеменения сельскохозяйственных животных и его практическое применение обеспечили большой успех в области улучшения генетики животных. Использование этого метода в сочетании с длительным хранением семени в замороженном состоянии открыло возможность получения десятков тысяч потомков от одного

производителя в год. Этот прием, по существу, решает проблему рационального использования производителей в практике животноводства.

Что касается самок, то традиционные методы разведения животных позволяют получать от них лишь несколько потомков за всю жизнь. Низкий уровень воспроизводства у самок и длительный интервал времени между поколениями (6—7 лет у крупного рогатого скота) ограничивают генетический процесс в животноводстве. Решение этой проблемы ученые видят в применении метода трансплантации эмбрионов. Суть метода состоит в том, что генетически выдающиеся самки освобождаются от необходимости вынашивания плода и вскармливания потомства. Кроме того, их стимулируют с целью увеличения выхода яйцеклеток, которые затем извлекают на стадии ранних зародышей и пересаживают менее ценным в генетическом отношении реципиентам.

Технология трансплантации эмбрионов включает такие основные звенья, как вызывание суперовуляции, искусственное осеменение донора, извлечение эмбрионов (хирургическое или нехирургическое), оценка их качества, кратковременное или длительное хранение и пересадка.

Стимуляция суперовуляции. Самки млекопитающих рождаются с большим (несколько десятков и даже сотен тысяч) числом половых клеток. Большинство из них постепенно погибают в результате атрезии фолликулов. Только небольшое число примордиальных фолликулов переходят в антральные в процессе роста. Однако практически все растущие фолликулы реагируют на гонадотропную стимуляцию, которая приводит их к конечному созреванию. Обработка самок гонадотропинами в фолликулярной фазе полового цикла или в лютеиновой фазе цикла в сочетании с индуцированием регрессии желтого тела простагландином Ф₂ (ПГФ₂) или его аналогами приводит к множественной овуляции или так называемой суперовуляции.

Крупный рогатый скот. Индукцию суперовуляции у самок крупного рогатого скота проводят обработкой гонадотропинами, фолликулостимулирующим гормоном (ФСГ) или сывороткой крови жеребой кобылы (СЖК), начиная с 9—14-го дня полового цикла. Через 2—3 дня после начала обработки животным вводят простагландин Ф_2а или его аналоги, чтобы вызвать регрессию желтого тела.

В связи с тем, что сроки овуляции у гормонально обработанных животных увеличиваются, изменяется и технология их осеменения. Первоначально рекомендовалось многократное осеменение коров с использованием нескольких доз спермы. Обычно вводят 50 млн. живых сперматозоидов в начале охоты и через 12—20 ч осеменение повторяют.

Извлечение эмбрионов. Эмбрионы крупного рогатого скота поступают из яйцевода в матку между 4-м и 5-м днем после начала охоты (между 3-м и 4-м днем после овуляции),

В связи с тем, что нехирургическое извлечение возможно только из рогов матки, то эмбрионы извлекают не ранее 5-го дня после начала охоты.

Несмотря на то что при хирургическом извлечении эмбрионов у крупного рогатого скота достигнуты отличные результаты, этот метод неэффективен — относительно дорогостоящий, неудобный для применения в условиях производства.

Нехирургическое извлечение эмбрионов состоит в использовании катетора.

Наиболее оптимальные сроки для извлечения эмбрионов — 6—8-й день после начала охоты, так как ранние бластоцисты этого возраста наиболее пригодны для глубокого замораживания и могут быть с высокой эффективностью пересажены нехирургическим способом. Корову-донора используют 6—8 раз в год, извлекая по 3—6 эмбрионов.

У овец и свиней нехирургическое извлечение эмбрионов невозможно ввиду трудности прохождения катетера через шейку в рога матки. Одна ко хирургическая операция у этих видов животных относительно проста и непродолжительна.

Пересадка эмбрионов. Параллельно с разработкой хирургического метода извлечения эмбрионов у крупного рогатого скота значительный прогресс был достигнут и в нехирургической пересадке эмбрионов. В пайету набирают свежую питательную среду (столбик длиной 1,0—1,3 см), затем небольшой пузырек воздуха (0,5 см) и далее основной объем среды с эмбрионом (2—3 см). После этого засасывают немного воздуха (0,5 см) и питательную среду (1,0—1,5 см). Пайету с эмбрионом помещают в катетер Кассу и до момента пересадки хранят в термостате при 37°С. Нажатием на шток катетера выдавливают содержимое пайеты вместе с эмбрионом в рог матки.

Хранение эмбрионов. Применение метода трансплантации эмбрионов потребовало разработки эффективных методов их хранения в период между извлечением и пересадкой. В производственных условиях эмбрионы обычно извлекают утром, а пересаживают в конце дня. Для хранения эмбрионов в течение этого времени используют фосфатный буфер с некоторыми модификациями при добавлении эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота и при комнатной температуре или температуре 37°С.

Наблюдения показывают, что эмбрионы крупного рогатого скота можно культивировать in vitro до 24 ч без заметного снижения их последующей приживляемости.

Пересадка эмбрионов свиней, культивируемых 24 ч, сопровождается нормальной приживляемостью.

Выживаемость эмбрионов в определенной степени может быть увеличена охлаждением их ниже температуры тела. Чувствительность эмбрионов к охлаждению зависит от вида животного.

Эмбрионы свиней особенно чувствительны к охлаждению. Пока не удалось сохранить жизнеспособность эмбрионов свиней на ранних стадиях развития после охлаждения их ниже 10—15°С (С. Полдж, 1982).

Эмбрионы крупного рогатого скота на ранних стадиях развития также очень чувствительны к охлаждению до 0°С.

Эксперименты последних лет позволили определить оптимальные соотношения между скоростью охлаждения и оттаивания эмбрионов крупного рогатого скота. Установлено, что если эмбрионы охлаждают медленно (1°С/мин) до очень низкой температуры (ниже— 50°С) с последующим переносом в жидкий азот, то они требуют и медленного оттаивания (25°С/мин или медленнее). Быстрое оттаивание таких эмбрионов может вызвать осмотическую регидратацию и разрушение. Если эмбрионы замораживают медленно (1°С/мин) только до - 25 и 40°С с последующим переносом в жидкий азот, то их можно оттаивать очень быстро (300°С/мин). В этом случае остаточная вода при переносе в жидкий азот трансформируется в стекловидное состояние (С. Вилладсен, 1980).

Выявление этих факторов привело к упрощению процедуры замораживания и оттаивания эмбрионов крупного рогатого скота. В частности, оттаивают эмбрионы, как и сперму, в теплой воде при 35°С в течение 20 с непосредственно перед пересадкой без применения специального оборудования с заданной скоростью повышения температуры.

Оплодотворение яйцеклеток вне организма животного

Разработка системы оплодотворения и обеспечения ранних стадий развития эмбрионов млекопитающих вне организма животного (in vitro) имеет огромное значение в решении ряда научных задач и практических вопросов, направленных на повышение эффективности разведения животных.

Для этих целей необходимы эмбрионы на ранних стадиях развития, которые можно извлечь только хирургическими методами из яйцеводов, что является трудоемким и не дает достаточного числа зародышей для проведения этой работы.

Оплодотворение яйцеклеток млекопитающих in vitro включает следующие основные этапы: созревание ооцитов, капацитацию сперматозоидов, оплодотворение и обеспечение ранних стадий развития.

Созревание ооцитов in vitro. Большое число половых клеток в яичниках млекопитающих, в частности у крупного рогатого скота, овец и свиней с высоким генетическим потенциалом, представляет источник огромного потенциала воспроизводительной способности этих животных в ускорении генетического прогресса по сравнению с использованием возможностей нормальной овуляции. У этих видов животных, как и других млекопитающих, число ооцитов, овулирующих спонтанно во время охоты, составляет только незначительную часть от тысяч ооцитов, находящихся в яичнике при рождении животного. Остальные ооциты регенерируют внутри яичника или, как говорят обычно, подвергаются атрезии. Естественно возникал вопрос, нельзя ли выделить ооциты из яичников путем соответствующей обработки и провести их дальнейшее оплодотворение вне организма животного. В настоящее время не разработаны методы использования всего запаса ооцитов в яичниках животных, но значительное число ооцитов может быть получено из полостных фолликулов для дальнейшего их созревания и оплодотворения вне организма.

В настоящее время применение на практике нашло созревание in vitro только ооцитов крупного рогатого скота. Ооциты получают из яичников коров после убоя животных и путем прижизненного извлечения, 1—2 раза в неделю. В первом случае яичники берут от животных после убоя, доставляют в лабораторию в термостатированном контейнере в течение 1,5—2,0 ч. В лаборатории яичники дважды промывают свежим фосфатным буфером. Ооциты извлекают из фолликулов, диаметр которых 2—6 мм, путем отсасывания или разрезания яичника на пластинки. Ооциты собирают в среду ТСМ 199 с добавлением 10 % сыворотки крови от коровы в охоте, затем дважды промывают и отбирают для дальнейшего созревания in vitro только ооциты с компактным кумулюсом и однородной цитоплазмой.

В последнее время разработан способ прижизненного извлечения ооцитов из яичников коров с помощью ультразвукового прибора или лапароскопа. При этом ооциты отсасывают из фолликулов, диаметр которых не менее 2 мм, 1—2 раза в неделю от одного и того же животного. В среднем получают однократно 5—6 ооцитов на животное. Менее 50 % ооцитов пригодны для созревания in vitro.

Положительное значение - несмотря на низкий выход ооцитов, при каждом извлечении возможность многократного использования животного.

Капацитация сперматозоидов. Важным этапом в разработке метода оплодотворения у млекопитающих было открытие явления капацитации спермиев. В 1951 г. М.К. Чанг и одновременно с ним Г.Р. Аустин установили, что оплодотворение у млекопитающих наступает только в том случае, если спермин в течение нескольких часов до овуляции находятся в яйцеводе животного. Основываясь на наблюдениях по изучению проникновения спермиев яйцеклетки крысы в различные сроки после спаривания Аустин ввел термин капацитации. Он означает, что в спермин должны произойти некоторые физиологические изменения до того, как сперматозоид приобретет способность к оплодотворению.

Разработано несколько методов капацитации эякулированных спермиев домашних животных. Для удаления белков с поверхности спермиев, которые, по-видимому, тормозят капацитацию спермиев, была использована среда с высокой ионной силой.

Однако наибольшее признание получил способ капацитации сперматозоидов с использованием гепарина (Дж. Парриш и др., 1985). Пайеты с замороженным семенем быка оттаивают в водяной бане при 39°С в течение 30—40 с. Примерно 250 мкл оттаянного семени подслаивают под 1 мл среды для капацитации. Среда для капацитации состоит из модифицированной среды Тиройда, без ионов кальция. После инкубации в течение одного часа верхний слой среды объемом 0,5—0,8 мл, содержащий большинство подвижных сперматозоидов, удаляют из пробирки и промывают дважды центрифугированием при 500 g в течение 7—10 мин. После 15 мин инкубации с гепарином (200 мкг/мл) суспензию разбавляют до концентрации 50 миллионов сперматозоидов в мл.

Оплодотворение in vitro и обеспечение ранних стадий развития эмбрионов. Оплодотворение яйцеклеток у млекопитающих осуществляется в яйцеводах. Это затрудняет доступ исследователя к изучению условий среды, в которой происходит процесс оплодотворения. Поэтому система оплодотворения in vitro была бы ценным аналитическим инструментом для изучения биохимических и физиологических факторов, включающихся в процесс успешного соединения гамет.

Применяют следующую схему оплодотворения in vitro и культивирования ранних эмбрионов крупного рогатого скота. Оплодотворение in vitro проводят в капле модифицированной среды Тироида. После созревания in vitro ооциты частичн

эмбриона.

33. Особенности оплодотворения яйцеклеток in vitro у самок разных видов

с.-х. животных

34. Оплодотворение яйцеклеток вне организма животного (in vitro). Капацитация сперматозоидов

Только что эякулированные сперматозоиды не способны к оплодотворению яйцеклетки. Они должны подвергнуться процессу капацитации до того, как приобретут способность прободать оболочки яйцеклетки. Капацитация обычно осуществляется внутри женских репродуктивных путей, хотя этот процесс можно индуцировать in vitro в соответствующих условиях культивирования. В процессе капацитации сначала удаляется гликопротеиновый слой с поверхностной мембраны сперматозоида, что в последующем приводит к реорганизации поверхностного слоя клеточной мембраны. У капацитированных сперматозоидов изменяются движения жгутика с регулярных волнообразных на хлыстоподобные. Такое биение жгутика способствует более эффективному движению сперматозоидов. Капацитированные сперматозоиды приобретают повышенную чувствительность к кальцию и имеют большее содержание цАМФ, что необходимо для осуществления акросомной реакции — следующего этапа процесса оплодотворения. Капацитация занимает несколько часов в условиях и in vivo, и in vitro. Акросомная реакция очень важна для оплодотворения, так как без нее сперматозоид не может пройти через блестящую оболочку яйцеклетки. Акросомная реакция начинается с взаимодействия капацитированного сперматозоида с блестящей оболочкой и связывания со специфическим гликоп-ротеиновым рецептором ZP3. Это приводит к еще большему вхождению кальция в цитоплазму сперматозоида и дальнейшему повышению содержания цАМФ. Акросома увеличивается в размерах, ее мембрана сливается с плазматической мембраной сперматозоида. Содержимое акросомы при этом высвобождается в окружающее пространство. Соединение мембраны акросомы с плазматической мембраной сперматозоида приводит и к тому, что обнажается внутренняя поверхность мембраны акросомы, содержащей белок ZP2 для связывания с блестящей оболочкой яйцеклетки. Взаимодействие ZP2 с блестящей оболочкой удерживает сперматозоид около яйцеклетки. Протеолитические ферменты акросомы разрушают участок блестящей оболочки в среднем за 15 мин. Как только сперматозоид достигает поверхности яйцеклетки, мембраны этих двух клеток сливаются. Ядро сперматозоида входит в цитоплазму яйцеклетки, где формирует мужской пронуклеус. Предупреждение полиспермии. Сразу после слияния сперматозоида с яйцеклеткой в цитоплазме последней возрастает концентрация ионов кальция, что запускает ряд важных процессов. Первый из них — деполяризация клеточной мембраны яйцеклетки, предотвращающая слияние с ней других сперматозоидов. Эту реакцию рассматривают в качестве первичной блокады полиспермии. Это означает, что для слияния с женским пронуклеусом достаточно только одного мужского пронуклеуса, чтобы восстановить диплоидный статус зиготы. Второй процесс — слияние с цитомембраной яйцеклетки специальных гранул, расположенных в цитоплазме как раз под цитомембраной, и высвобождение содержимого этих гранул в пространство между цитомембраной яйцеклетки и блестящей оболочкой. Это событие — кортикальная реакция — служит для нарушения способности блестящей оболочки связывать другие сперматозоиды. Кортикальную реакцию рассматривают в качестве вторичной блокады полиспермии.

35. Использование новейших достижений биологической науки в биотехнике размножения животных

Биотехноло́гия — дисциплина, изучающая возможности использования живых организмов, их систем или продуктов их жизнедеятельности для решения технологических задач, а также возможности создания живых организмов с необходимыми свойствами методомгенной инженерии.

Биотехнологией часто называют применение генной инженерии в XX—XXI веках, но термин относится и к более широкому комплексу процессов модификации биологических организмов для обеспечения потребностей человека, начиная с модификации растений и животных путем искусственного отбора и гибридизации. С помощью современных методов традиционные биотехнологические производства получили возможность улучшить качество пищевых продуктов и увеличить продуктивность живых организмов.

В качестве трансгенных животных чаще всего используются свиньи. Например, есть свиньи с человеческими генами — их вывели в качестве доноров человеческих органов.

Японские генные инженеры ввели в геном свиней ген шпината, который производит фермент FAD2, способный преобразовывать жирные насыщенные кислоты в линолевую — ненасыщенную жирную кислоту. У модифицированных свиней на 1/5 больше ненасыщенных жирных кислот, чем у обычных.^[11]

Зелёные светящиеся свиньи — трансгенные свиньи, выведенные группой исследователей из Национального университета Тайваня путём введения в ДНК эмбриона гена зелёного флуоресцентного белка, позаимствованного у флуоресцирующей медузы Aequorea victoria. Затем эмбрион был имплантирован в матку самки свиньи. Поросята светятся зелёным цветом в темноте и имеют зеленоватый оттенок кожи и глаз при дневном свете. Основная цель выведения таких свиней, по заявлениям исследователей, — возможность визуального наблюдения за развитием тканей при пересадке стволовых клеток.

Роль биотехники размножения в племенной работе, создании новых и совершенствовании существующихпород животных, в ускорении селекционного процесса, повышении его возможностей

В настоящее время существуют исключительно благоприятные предпосылки для дальнейшего развития биотехники размножения животных. Особенно большой прогресс достигнут в разработке и совершенствовании методов искусственного осеменения и трансплантации эмбрионов. Это открыло большие перспективы в управлении процессами размножения сельскохозяйственных животных:

- использование биотехники создает богатейшие возможности для селекционной работы (использование высокоценных производителей, животных с наиболее желательными селекционными признаками, индивидуальный подбор пар, использование производителей-улучшате-лей, создание генетических банков, ускорение интервала между поколениями);

- возможность получения гибридов;

- предупреждение инфекций и инвазий;

- увеличение рождения двоен;

- использование животных для воспроизводства при некоторых формах бесплодия у них;

- обмен генофондом между странами;

- использование трансплантации эмбрионов для генной инженерии (получение трансгенных и химерных животных и т.д.).

- Широкое применение биотехники размножения животных ставит на новый, неизмеримо более высокий уровень селекционно-племенную работу, делает реальной задачу создания уже в 2010-2015 гг. молочных стад с годовой продуктивностью 12000-15000 кг молока, получения 150-160 телят на каждые 100 коров ежегодно.