Глава 2. Трансфекция
Трансфекция — процесс введения нуклеиновой кислоты в клетки человека и животных невирусным методом. Аналогичный процесс в отношении бактерий, дрожжей и растений называется трансформация.
Трансфекция обычно включает образование в плазматической мембране отверстий через которые внутрь клетки может проникать внеклеточный материал. Трансфицирован может быть генетический материал, такой как ДНК или РНК, а также белки, например, антитела. Для трансфекции часто используют сильное электрическое поле (электропорация) или электростатически заряженные липиды, способные к образованию липосом, структур, которые сливаются с плазматической мембраной, выбрасывая внутрь клетки заключенный в них материал. Известны и другие методы трансфекции.
Первоначальный смысл слова трансфекция: инфекция для трансформации, т.е. введение в клетки вирусного генома, в результате чего начинается инфекция. Но, поскольку в приложении к человеку и животным термин трансформация имеет иное значение (генетические изменения, позволяющие вести клетки в культуре в течение длительного времени, преодолевая лимит Хейфлика, что типично, например, для раковых клеток), термин трансфекция было предложено использовать как замену термину трансформация в смысле изменения фенотипа путем введения чужеродной нуклеиновой кислоты.
1) Методы трансфекции
Материалы, используемые для трансфекции, относятся к трем основным типам: микрочастицы, катионные полимеры и липосомы.
Один из самых дешевых и наименее надежных методов является кальций-фосфатная трансфекция, изобретенная в 70-х годах ХХ века. Изотонический раствор, содержащий буфер HEPES, фосфат и ДНК, смешивают с хлористым кальцием. Образуется осадок из частиц фосфата кальция и ДНК, размер которых лежит в нанометровом диапазоне. Суспензию добавляют к культуре клеток, которые поглощают частицы (как именно, авторы не уточняли). Лучше всего такая трансфекция проходит с эмбриональными клетками почки человека линии 293, но с несколько меньшей эффективностью трансфицируются и многие другие линии.
Более эффективен метод, в котором используют липосомы, структуры, много меньшие по размерам, чем клетки, состоящие из липидной мембраны, окружающей ДНК в водной фазе. Их строение напоминает строение клеток, которые тоже окружены фосфолипидной мембраной. Липосомы могут сливаться с клеточной мембраной, после чего их внутреннее пространство сливается с содержимым клеток. Для образования липосом обычно используют положительно заряженные липиды, т.к. ДНК и клеточные фосфолипиды заряжены отрицательно, а частицы с разным электростатическим зарядом притягиваются друг к другу.
Еще один метод трансфекции - использование положительно заряженных водорастворимых полимеров, таких как ДЭАЭ-декстран или полиэтиленимин. Отрицательно заряженная ДНК связывает поликатионы, и образовавшийся комплекс поглощается клетками путем эндоцитоза.
ДНК может быть также введена в клетки путем микроинъекции или с помощью "генной пушки". Последняя использует микрочастицы инертного твердого вещества (обычно золота), к которым пришита ДНК.
Среди прочих методов трансфекции можно упомянуть электропорацию, нуклеофекцию, тепловой шок, использование магнитных частиц, и множество коммерческих реагентов, распространяемых изготовителями продукции для научных исследований.
Кроме того, ДНК может быть доставлена в клетки вирусами. В таком случае процесс называют трансдукция, а клетки трансдуцированными.
2) Трансфекция стабильная и транзиентная Нередко для решения поставленной задачи достаточно ввести ДНК в клетки лишь на какое-то время, достаточное для ее экспрессии. Т.к. трансфицированная ДНК обычно не включается в ядерный геном и не реплицируется, чужеродная ДНК быстро теряется по мере размножения клеток. Такая трансфекция называется транзиентной.
Если необходимо закрепить введенный ген и в потомстве трансфицированых клеток, то его следует включить в ядерный геном. Такая трансфекция называется стабильной. Для этого в клетки вводят еще один ген, который облегчает селекцию трансфицированных клеток и поэтому именуется маркером селекции. Например, маркером селекции может быть ген резистентности к некоторому антибиотику. Некоторые клетки совершенно случайно включают чужеродную ДНК в свой геном, и задача в таком случае, состоит лишь в том, чтобы отобрать потомство таких клеток (клон), что несложно сделать в присутствии антибиотика, губительного для всех клеток кроме трансфицированных.
В качестве антибиотиков, применяемых для селекции трансфицированных клеток, часто применяют генетицин, известный также как G418, пуромицин, доксимицин и др.
Встраивание чужеродной ДНК в клеточный геном происходит благодаря наличию в клетке механизма репарации. Поэтому эффективность встраивания увеличивается, если вводимая в клетки ДНК является линейной, а не кольцевой, какими обычно бывают бактериальные плазмиды. Конечно, наличие в клетках рестриктаз в какой-то мере обеспечивает случайную линеаризацию кольцевых плазмид, но она может происходить и по гену селекции или гену, который должен быть встроен в геном. Поэтому обычно при подготовке стабильной трансфекции генноинженерные конструкции предварительно линеаризуют.
Еще большей подготовительной работы требует встраивание гена в определенное место в геноме, что требуется, например, для генетического нокаута. В таком случае в геннноинженерной конструкции кассета вводимых в хромосому генов должна находиться между двух участков, комплементарных хромосомной ДНК, длиной 1000-3000 пар нуклеотидов (так называемых плеч).
__________ 1. Graham FL, van der Eb AJ (1973). «A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA». Virology 52 (2): 456–67.
2. Сингер М., Берг П. Гены и геномы. — Москва, 1998.
3. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning. - 1989.
Глава 3. Трансдукция Трансдукция (от лат. transductio — перемещение) — процесс переноса бактериальной ДНК из одной клетки в другую бактериофагом. Общая трансдукция используется в генетике бактерий для картирования генома и конструирования штаммов. К трансдукции способны как умеренные фаги, так и вирулентные, последние, однако, уничтожают популяцию бактерий, поэтому трансдукция с их помощью не имеет большого значения ни в природе, ни при проведении исследований. 1) Поведение фагов в бактериальной клетке Фаги способны к реализации двух путей развития в бактериальной клетке:
Литический — после попадания в бактерию ДНК фага сразу же начинается его репликация, синтез белков и сборка готовых фаговых частиц, после чего происходит лизис клетки. Фаги, развивающиеся только по такому сценарию, называют вирулентными.
Лизогенный — попавшая в бактериальную клетку ДНК фага встраивается в её хромосому или существует в ней как плазмида, реплицируясь при каждом делении клетки. Такое состояние бактериофага носит название профаг. Система его репликации в этом случае подавлена синтезируемыми им самим репрессорами. При снижении концентрации репрессора профаг индуцируется и переходит к литическому пути развития. Реализующие подобную стратегию бактериофаги называются умеренными. Для некоторых из них стадия профага является обязательной, другие в некоторых случаях способные сразу развиваться по литическому пути.
2) Перенос фрагментов ДНК бактерии Общая (неспецифическая) трансдукция
Осуществляется фагом P1, существующим в бактериальной клетке в виде плазмиды, фагами P22 и Mu, встраивающимися в любой участок бактериальной хромосомы. После индуцирования профага с вероятностью в 10−5 на одну клетку возможна ошибочная упаковка фрагмента ДНК бактерии в капсид фага, ДНК самого фага в нём в этом случае нет. Длина этого фрагмента равна длине нормальной фаговой ДНК, его происхождение может быть любым: случайный участок хромосомы, плазмида, другие умеренные фаги.
Попадая в другую бактериальную клетку, фрагмент ДНК может включаться в её геном, обычно путём гомологичной рекомбинации. Перенесённые фагом плазмиды способны замыкаться в кольцо и реплицироваться уже в новой клетке. В ряде случаев фрагмент ДНК не встраивается в хромосому реципиента, не реплицируется, но сохраняется в клетке и транскрибируется. Это явление носит название абортивной трансдукции.
Специфическая трансдукция.
Наиболее хорошо изучена специфическая трансдукция на примере фага λ. Этот фаг встраивается только в один участок (att-сайт) хромосомы E. coli с определённой последовательностью нуклеотидов (гомологичной att-участку в ДНК фага). Во время индукции его исключение может пройти с ошибкой (вероятность 10−3—10−5 на клетку): вырезается фрагмент тех же размеров что и ДНК фага, но с началом не в том месте. При этом часть генов фага теряется, а часть генов E. coli захватывается им. Вероятность переноса гена в этом случае падает при увеличении расстояния от него до att-сайта.
Для каждого специфически встраивающегося в хромосому умеренного фага характерен свой att-сайт и, соответственно, расположенные рядом с ним гены, которые он способен передавать. Ряд фагов может встраиваться в любое место на хромосоме и переносить любые гены по механизму специфической трансдукции. Кроме того, в хромосоме обычно есть последовательности, частично гомологичные att-участку ДНК фага. При повреждении полностью гомологичного att-сайта можно добиться включения фага в хромосому по этим последовательностям и передачу в ходе специфической трансдукции генов, соседних уже с ними.
Когда умеренный фаг, несущий бактериальные гены, встраивается в хромосому новой бактерии-хозяина, она содержит уже два одинаковых гена — собственный и принесённый извне. Поскольку фаг лишён части собственных генов, часто он не может индуцироваться и размножиться. Однако при заражении этой же клетки «вспомогательным» фагом того же вида, индуцирование дефектного фага становится возможным. Из хромосомы выходят и реплицируются как ДНК нормального «вспомогательного» фага, так и ДНК дефектного, вместе с переносимыми им бактериальными генами. Поэтому около 50% образующихся фаговых частиц несут бактериальную ДНК. Это явление носит название трансдукции с высокой частотой (HFT от англ. high frequency transduction).
__________
1.Alberts et al. Molecular Biology of the Cell
2.T.A.Brown. Genomes
3.Крупнейший в России портал молекулярных биологов
4.Ковалёва Е. Н. Создание биопрепарата на основе выделенных и изученных бактериофагов Enterococcus faecalis: Дис. … канд. биол. наук. — Саратов, 2009. — 151 с.