3.Открытие микроорганизмов. Основные методы микроскопирования. Методы окраски. Изучение морфологии и отдельных структур.

Доказательство существования невидимых возбудителей болезней стало возможным после изобретения микроскопа. Приоритет в открытии микроорганизмов принадлежит голландскому натуралисту-любителю Антонио Левенгуку (1б32. 1723). Торговец полотном А. Левенгук увлекался шлифованием стекол и довел это искусство до совершенства, сконструировав микроскоп, позволивший увеличивать рассматриваемые предметы в 300 раз.

Изучая под микроскопом различные объекты (дождевую воду, настои, зубной налет, кровь, испражнения, сперму), А. Левенгук наблюдал мельчайших животных, которых он назвал анималькулюсами.

Таким образом, с изобретением микроскопа А.Левенгуком начинается следующий этап в развитии микробиологии, получившего название морфологического.

Он первый увидел, как кровь циркулирует в мельчайших кровеносных сосудах. Обнаружил, что кровь - это не однородная жидкость, как думали его современники, а живой поток, в котором движется великое множество мельчайших частиц. Теперь их называют эритроцитами. Очень важно и другое открытие Левенгука: в семенной жидкости он впервые увидел сперматозоиды. Рассматривая под сконструированной им лупой тонкие пластинки мяса, Левенгук обнаружил, что мясо, или, точнее говоря, мышцы, состоит из микроскопических волоконец. При этом мышцы конечностей и туловища (скелетные мышцы) состоят из поперечноисчерченных волоконец, почему их и стали называть поперечнополосатыми, в отличие от гладких мышц, которые находятся в большинстве внутренних органов (кишечнике и др.) и в стенках кровеносных сосудов. Но самое важное открытие Левенгука-существование микроорганизмов, которые играют огромную роль в природе и в жизни человека. Левенгук был первым человеком, который увидел микробов. Это замечательное открытие он мог совершить только потому, что своими руками сделал увеличительные стекла. 'Микроскоп' Левенгука - это, по существу, очень сильная лупа. Она увеличивала до 300 раз.

Микроскопия – метод исследования микрообъектов, клеток и их органоидов с помощью специального оптического прибора – микроскопа. Микроскоп дает возможность различать структуры с расстоянием между элементами до 0,20 мкм, определять форму, размеры, строение и многие другие характеристики изучаемых микрообъектов. Применяют световую, электронную и рентгеновскую микроскопию.

Обычный световой микроскоп увеличивает в 1,5-2 тысячи раз. Для увеличения числовой апертуры объектива используют иммерсионные жидкости, что соответственно позволяет несколько увеличить разрешающую способность объектива. Механическая часть микроскопа включает штатив, предметный столик, макро- и микрометрический винты, тубус, тубусодержатель.

Электронный микроскоп, в котором увеличенное изображение получается не с помощью световых лучей, а с помощью потока электронов, а стеклянные линзы заменены электромагнитными полями.

Поляризационная микроскопия позволяет получать изображения неокрашенных анизотропных структур (например, коллагеновых волокон, миофибрилл или клеток микроорганизмов). Принцип метода основан на изучении объекта в свете, образованном двумя лучами, поляризованными во взаимно перпендикулярных плоскостях.

Светлопольная микроскопия

Светлопольная микроскопия осуществляется с помощью обычного светового микроскопа, основной частью которого является объектив. При исследовании микробов применяется иммерсионная система (объектив). Иммерсионный объектив погружают в каплю кедрового масла, нанесенного на препарат. Кедровое масло имеет такой же коэффициент преломления, как и стекло, и этим достигается наименьшее рассеивание световых лучей.Изображение, получаемое в объективе, увеличивает окуляр, состоящий из двух линз.

Темнопольная микроскопия

Микроскопия в темном поле зрения основана на следующем принципе. Лучи освещают объект не снизу, а сбоку и не попадают в глаза наблюдателя, поле зрения остается темным, а объект на его фоне оказывается светящимся. Это достигается с помощью специального конденсора (параболоид), или обычного конденсора, прикрытого в центре кружком черной бумаги.

Препараты для темнопольной микроскопии готовят по типу раздавленной капли. Исследуемый материал (бактериальная культура в физиологическом растворе) наносят на предметное стекло, которое покрывают покровным . Капля материала заполняет все пространство между покровным и предметным стеклом, образуя ровный слой. Темнопольная микроскопия используется для изучения живых неокрашенных микроорганизмов.

Люминесцентная микроскопия

Люминесцентная микроскопия основана на способности некоторых веществ под влиянием падающего на них света испускать лучи с другой (обычно большей) длиной волны (флюоресцировать). Такие вещества называют флюорохромами (акридиновый желтый, ФИТЦ, родамин и др.). Объект, обработанный флюорохромом, при освещении ультрафиолетовыми лучами приобретает яркий цвет в темном поле зрения. Электронная микроскопия

Возможности оптических микроскопов ограничены слишком большой длиной волны видимого света (6000 А). Объекты, размеры которых меньше этой величины, находятся за пределами разрешающей способности светового микроскопа. В электронном микроскопе вместо световых волн используются электронные лучи, обладающие чрезвычайно малой длиной волны и высокой разрешающей способностью.

Окрашенные препараты

Для приготовления окрашенных препаратов из исследуемого объекта готовят мазки и фиксируют их.

Окрашивание. Стандартные красители, используемые для окраски бактерий - карболовый фуксин Циля, фуксин Пфайффера и метиленовый синий по Лёффлеру. Для получения более информативных результатов в светооптической микроскопии используют специальные и дифференцирующие методы окраски.

Специальные методы окраски бактерий. Наибольшее распространение нашли методы Грама и Циля-Нильсена

Дифференцирующие методы обычно применяют для окрашивания различных морфологических структур.

Капсулы. Для окраски капсул бактерий применяют методы Бури-Гинс и Антони; последний метод наиболее прост и включает окраску кристаллическим фиолетовым с последующей обработкой 20% водным раствором CuSO₄.

Жгутики. Для окраски жгутиков предложены методы Лёффлера, Бейли, Грея и др. Для этих методов характерны первоначальное протравливание препарата [обычно растворами таннина, KAl(SO₄)₂, HgCl₂] и последующая окраска (чаще карболовый фуксин Циля).

Споры. Окраску спор бактерий проводят после предварительной обработки их стенок. Наиболее прост метод Пешкова, включающий кипячение мазка с синькой Лёффлера на предметном стекле с последующей докраской нейтральным красным. Споры окрашиваются в синий цвет, вегетативные клетки -- в розовый. Окраска по Граму относится к сложному способу окраски, когда на мазок воздействуют двумя красителями, из которых один является основны́м, а другой — дополнительным. Кроме красящих веществ при сложных способах окраски применяют обесцвечивающие вещества: спирт, кислоты и др.Для окраски по Граму чаще используют красители трифенилметановой группы: генциановый, метиловый фиолетовый или кристаллвиолет. Грамположительные Грам (+) микроорганизмы дают прочное соединение с указанными красителями и йодом. При этом они не обесцвечиваются при воздействии на них спиртом, вследствие чего при дополнительной окраске фуксином Грам (+) микроорганизмы не изменяют первоначально принятый фиолетовый цвет.Грамотрицательные Грам (−) микроорганизмы образуют с основными красителями и йодом легко разрушающееся под действием спирта соединение. В результате микробы обесцвечиваются, и затем окрашиваются фуксином, приобретая красный цвет.

ФиксацияПри фиксировании мазок закрепляется на поверхности предметного стекла, и поэтому при последующей окраске препарата микробные клетки не смываются. Кроме того, убитые микробные клетки окрашиваются лучше, чем живые.Различают физический способ фиксации, в основу которого положено воздействие высокой температуры на микробную клетку, и химические способы, предусматривающие применение химических средств, вызывающих коагуляцию белков цитоплазмы.Физический способ фиксации Предметное стекло с препаратом берут пинцетом или I и II пальцами правой руки за рёбра мазком кверху и плавным движением проводят 2—3 раза над верхней частью пламени горелки. Весь процесс фиксации должен занимать не более 2 с.Химический способ фиксации Для фиксации мазков применяют метиловый спирт, ацетон, смесь Техника окрашивания по методу ПешковаВ результате зрелые эндоспоры окрашиваются в голубой цвет, молодые - в темно-синий, цитоплазма красная, зерна хроматина окрашиваются в фиолетовый цвет.

5. Строение и хим состав Кл стенки Г+ и Г-. Бактерии с дефектом синтеза Кл стенки.

Поверхностный слой, расположенный снаружи от цитоплазматической мембраны, называют клеточной стенкой. Стенка выполняет защитную и опорную функции, а также придает клетке постоянную, характерную для нее форму (например, форму палочки или кокка) и представляет собой наружный скелет клетки. Внутри бактериальной клетки осмотическое давление в несколько раз, а иногда и в десятки раз выше, чем во внешней среде. Поэтому клетка быстро разорвалась бы, если бы она не была защищена такой плотной, жесткой структурой, как клеточная стенка.

Толщина клеточной стенки 0,01-0,04 мкм. Она составляет от 10 до 50% сухой массы бактерий. Основным структурным компонентом стенок является муреин (гликопептид, мукопептид). Это органическое соединение сложного строения, в состав которого входят сахара, несущие азот, — аминосахара и 4-5 аминокислот. Составные части клеточной стенки, ее компоненты, образуют сложную прочную структуру. С помощью способа окраски Грамом, бактерии могут быть разделены на две группы: грамположительные и грамотрицательные. Грамположительные организмы способны связывать некоторые анилиновые красители, такие, как кристаллический фиолетовый, и после обработки иодом, а затем спиртом (или ацетоном) сохранять комплекс йод-краситель. Те же бактерии, у которых под влиянием этилового спирта этот комплекс разрушается (клетки обесцвечиваются), относятся к грамотрицательным.

Клеточная стенка проницаема: через нее питательные вещества свободно проходят в клетку, а продукты обмена выходят в окружающую среду. Крупные молекулы с большим молекулярным весом не проходят через оболочку.

У грамположительных бактерий (например, у стафилококков или микрококков) клеточная стенка состоит из многослойной структуры толщиной 70-80 нм, называемой пептидогликаном. Пептидогликановый мешок состоит из полисахаридных цепей, связанных между собой в единую сеть пептидными мостиками. На его долю у грамположительных бактерий приходится до 80% веса их клеточных оболочек. Кроме пептидогликана в состав клеточных стенок этих бактерий входят тейхоевые кислоты. Тейхоевые кислоты вследствие присутствия в их составе фосфорной кислоты обеспечивают создание на поверхности клеток грамположительных бактерий электроотрицательного заряда. Тейхоевые кислоты присутствуют только у грамположительных бактерий.Основным отличием в строении оболочек грамположительных и грамотрицательных бактерий является наличие у последних кроме цитоплазматической еще одной, так называемой внешней мембраны. Данная структура, расположенная над тонким, одно-трехслойным пептидогликановым мешком (8 нм), является типичной двуслойной мембраной, в которой выявлено довольно много достаточно уникальных компонентов: липополисахаридов, липопротеинов, а также белков - поринов, из которых образованы поры во внешней мембране, позволяющие проникать в оболочку (и из нее в среду) сравнительно низкомолекулярным соединениям (в частности, комплексу кристалл-фиолетового с иодом - определяющему окрашивание по Граму).ПРОТОПЛА́СТ, все содержимое клетки, за исключением клеточной оболочки. Английский ученый Э. Коккинг в 1960 предложил способ получения жизнеспособных протопластов путем обработки плазмолизированной ткани растений ферментами грибов, разрушающими клеточную оболочку. Протопласты могут образовываться также у дрожжей и других микроорганизмов в результате автолиза, мутаций, действия антибиотиков и других агентов, приводящих к потере клеточной оболочки. Микоплазмы и L-формы бактерий также представляют собой протопласты. Экспериментальным путем их получают чаще всего при действии на клетки различными гидролазами. Высокая осмотическая чувствительность протопластов позволяет легко их лизировать и получать нативные макромолекулы и структурные компоненты клетки, необходимые для проведения генетических и молекулярно-биологических исследований. Сферопласт - бактериальная клетка с частично разрушенной (редуцированной) клеточной стенкой, характеризующаяся неустойчивостью к изменениям осмотического давления. Сначала получают сферопласты путем обработки клеток лизоцимом в изотоническом растворе. L-формы — бактерии, частично или полностью лишённые клеточной стенки, но сохранившие способность к развитию. Буква L — первая буква названия Листеровского института в Лондоне, где впервые Эмми Кляйнебергер-Нобель обратила внимание на развитие морфологически весьма необычных клеток в культуре бактерий Streptococcus momliforniis, выделенной из жидкости уха крысы. Позже были описаны L-формы у самых разных видов бактерий. Было показано, что L-формы возникают спонтанно или индуцировано - под воздействием агентов, блокирующих синтез клеточной стенки (антибиотиков пенициллинового ряда и циклосерина, ультрафиолетовых и рентгеновских лучей, аминокислоты глицина).L-формы образуются в результате несбалансированного роста нормальных бактериальных клеток в длину и в толщину и поэтому полиморфны. Они шаровидные, нитевидные, присутствуют также и бесструктурные массы. L-формы проходят через бактериальные фильтры и легко разрушаются при механических воздействиях.В отличие от нормальных клеток L-формы часто содержат крупные вакуоли. L-формы обладают пониженным уровнем метаболической активности, чем исходные бактерии. Они нечувствительны к действию любых агентов, влияющих на клеточную стенку.

У L-форм не функционируют нормальные механизмы клеточного деления. В основном они делятся с образованием элементарных тел, которые отпочковываются от поверхности клетки или от мембраны вакуоли.

Различают стабильные и нестабильные L-формы. Нестабильные L-формы обладают элементами клеточной стенки и поэтому способны превращаться в нормальные бактериальные клетки после исключения действия фактора, вызвавшего их образование. Стабильные L-формы полностью лишены ригидной клеточной стенки, что сближает их с протопластами. Они крайне редко возвращаются в исходные бактериальные формы и существуют без изменений в различных условиях среды. Исследования L-форм представляют существенный интерес для медицинской микробиологии, поскольку в этой форме в организме человека и животных могут сохраняться патогенные бактерии. При нерациональном использовании антибиотиков, приводящем к образованию L-форм из бактерий, может наступить улучшение состояния больного. Однако после прекращения приема лечебного препарата наступает превращение L-форм в бактерии исходного вида с восстановлением их вирулентности, что приводит к рецидиву болезни. Бактерии, у которых отсутствует клеточная стенка, существуют и в природе: это микоплазмы. Первым описанным представителем микоплазм явился возбудитель плевропневмонии крупного рогатого скота. Подобные микроорганизмы обнаружены и у других животных - овец, коз, крыс, собак, а также у человека, всем им было дано общее название PPLO (плевропневмониеподобные организмы).

4.Систематика микроорганизмов. Принципы классификации. Понятие вид. Таксономические категории. Номенклатура. Отличия про- от эукариот.Левенгук отметил возможность дифференцировать микроорганизмы по морфологическим признакам. Позже предпринимали попытки классифицировать микроорганизмы с целью распределения их по таксонам на основании морфологических и физиологических признаков.Вид – эволюционно сложившаяся совокупность особей, имеющих единый тип организации, который в стандартных условиях проявляется сходными фенотипическими признаками: морфологическими, физиологическими, биохимическими и др.Перечисленные признаки в пределах одного и того же вида могут варьировать =» варианты (вары) микроорганизмов, отличающиеся отдельными признаками от стандартных.Виды, связанные генетическим родством объединяют в роды –» семейства –« …царства и подцарства.Патогенные бактерии относятся к надцарству прокариотов, царству эукариотов, грибы – к царству микота, простейшие – к ц –ву протозоа, вирусы – к ц ВираВ основе современной систематики лежат фенотипические признаки. Морфологические характеризуют форму и структуру микробной клетки, физиологические – особенности роста микроорганизма на искусственных пит средах, морфологию колоний, биохимические – тип окислительного и пластического метаболизма, ферментацию углеводов, протеолит признаки.В настоящее время используют ряд таксономических систем: нумерическая, хемотаксономия, генетическая и серологическая таксономии.Для названия микроорганизмов используется биноминальная номенклатура Линнея: первое слово –род, второе –вид. Обычно название рода дается по фамилии автора, либо по его принадлежности к определенной морфологической группе. Видовое название связано с наименованием заболевания, либо с источником обитания.Штамм - культура, выделенная из определенного источника, или из одного и того же источника в разное время. Клон – культура микроорганизмов, выделенная из одной клетки. Чистая культура – микробные особи одного и того же вида, выращенные на изолированной колонии, выращенной на твердой питательной среде.

У прокариот отсутствует мембрана, с помощью которых органеллы микробной клетки ограничены от цитоплазмы. У прокариот имеется только цитоплазм мембрана, отделяющая цитоплазму от клеточной оболочки или от внешней среды. Ядро (нуклеоид) имеет фибриальную структуру и не ограничено от цитоплазмы ядерной мембраной. В клетках прокариот отсутствуют митохондрии, хлоропласты, КГ. ОВ ферменты локализованы а производных образованиях цитоплазматической мембраны – мезосомах. У прокариот отсутствует митоз, размножаются бинарным делением. Существую в гаплоином состоянии. Отсутствует у них клеточный центр. Для них нетипичны внутриклеточные перемещения цитоплазмы и амебовидное движение.