2.4 Методы идентификации микроорганизмов
Изучение фенотипических признаков микроорганизмов-деструкторов проводили стандартными микробиологическими методами [12,14]. При идентификации бактериальных изолятов проводили сравнительный анализ их морфологических, культуральных, биохимических свойств. Определяли морфологию вегетативных клеток, спорообразование, подвижность, окраску по Граму, каталазную, оксидазную, амилазную, липазную, лецитиназную, левансахаразную и протеиназную активность, образование кислоты из глюкозы, лактозы, сахарозы, мальтозы и маннита, восстановление нитратов и потребность в факторах роста.
Принадлежность изучаемых культур к группе грамположительных или грамотрицательных бактерий определяли экспресс-методом Грезерсона. Клетки культур помещали бактериологической петлей в каплю 3%-го раствора КОН на предметное стекло, размешивали круговыми движениями и через 5-6 секунд петлю резко поднимали. Суспензия грамотрицательных бактерий становилась вязкой и тянулась за петлей, образуя тяжи. Грамположительные бактерии равномерно распределялись в капле щелочи. Реакцию считали отрицательной, если образование слизистых тяжей не наблюдалось в течение 60 секунд.
При изучении физико-химических свойств культур, определяли их способность продуцировать каталазу. С помощью бактериологической петли клетки культур перенесли на предметное стекло. Поместили одну каплю 3% раствора пероксида водорода на материал на предметном стекле. Положительная реакция проявлялась быстрым появлением пузырьков газа. При отрицательной реакции в течение 20 секунд выделение газа не происходило.
Для выявления амилолитической активности использовали среду следующего состава (г/л): пептон – 10.0; КН2РО4 – 5.0; растворимый крахмал - 2.0; агар – 15.0; рН среды 6,8 – 7.0. Среду стерилизовали при температуре 121 ºС 30 минут и разлили в стерильные чашки Петри. Исследуемые микроорганизмы высевали штрихом по диаметру чашки. Продолжительность культивирования составила 7 суток, при температуре 30ºС. Гидролиз крахмала обнаруживали после обработки агаровой поверхности раствором Люголя. Для этого на поверхность среды наливали 3-5 мл раствора Люголя, после чего среда окрашивалась в синий цвет, а зоны гидролиза крахмала приобретали красно-бурую окраску (Рисунок 4).
Рисунок 4 - Тест на амилазную активность
Так же изучали протеолитическую активность у микроорганизмов. Для этого культуры высевали на мясопептонную желатину (МПЖ). К 100 мл мясопептонного бульона (МПБ) добавили 15 г желатины, оставили на 15 минут, чтобы она набухла, затем нагрели на водяной бане до полного растворения желатины и разлили в пробирки по 10 мл. Стерилизовали при температуре 121 ºС 15 минут. Посев проводили уколом. Продолжительность культивирования составило 10 суток при комнатной температуре. Разжижение желатины отмечали визуально.
Для выявления липазной и лецитиназной активности использовали желточно-солевую среду следующего состава: к 100 мл расплавленного и охлажденного до 60-70 ºС стерильного МПА(pH 7,2), содержащего 10 г NaCl, добавляли 10-20 мл желточной взвеси, перемешивали и разливали в чашки Петри. Исследуемые микроорганизмы высевали штрихом по диаметру чашки. Продолжительность культивирования составила 3 суток, при температуре 27 ºС. Визуально отмечали при лецитиназной активности помутнение снизу колоний, а при липазной активности блестящий налет сверху колоний.
Оксидазную активность выделенных изолятов бактерий определяли с помощью тест-полосок окситест (MIKRO-LA-TEST) (Рисунок 5).
а
б
Рисунок 5 - Оксидазная активность: а – отрицательная;
б – положительная.
Способность исследуемых культур ферментировать углеводы изучали на универсальных средах Гисса. В состав этих сред входят: панкреатический гидролизат кильки, индикатор и различные углеводы (глюкоза, сахароза, лактоза, мальтоза, манит). Среду готовили следующим образом – 15 грамм препарата размешивали в 1 литре дистиллированной воды, кипятили до полного растворения. Разлили в стерильные пробирки. Засев проводили уколом, культивировали в течение 3 дней. Визуально отмечали образование газа и кислоты (Рисунок 6).
Рисунок 6 - Рост бактерий на средах Гисса
Потребность в факторах роста бактерий изучали на среде Фратера(г/л): (NH4)2SO4 – 1.0; MgSO4˟7H2O – 0.25; водопроводная вода, K2HPO4 – 0.1; глюкоза – 10.0; pH= 6.0-7.0. Среду разлить в пробирки по 5мл. Охарактеризовать рост: слабый, умеренный, обильный. Охарактеризовать пленку на поверхности пробирки, встряхнуть и через неделю опять посмотреть пленку, так как после посева с богатой среды идет адаптация к новым условиям.
Для образования левансахаразы изучается на среде с сахарозой и мелом. В состав среды входят дрожжевая вода, сахароза – 5%, агар – 2%, CaCO3 – 1%, pH = 6.8-7.0. Стерилизовать при 0.5 атм. Посев осушевствляется штрихом на чашки Петри. Образующийся леван представляет собой сиропрастекающуюся массу.
Для восстановление нитратов используют среду Абдельмалека (%): МПБ, глюкоза – 1.0, агар – 0.3, KNO3 – 1.0, pH = 7.0. Растворить МПБ, глюкозу и KNO3, довести pH до 7.0 и внести агар. Все это расплавить и разлить в пробирки по 10-12 мл. Засев проводят уколом, после чего заливают голодным агаром. Посев описывают через 5-6 дней или даже позже. Отмечают наличие роста по уколу и наличие полостей между средой и столбиком голодного агара.