Глава III экспериментальная часть

Нами были проанализированы 12 линий и сортов кукурузы и популяция сахарной кукурузы, полученная на кафедре общей генетики, селекции и семеноводства КБГУ на основе мутантных линий, с использованием RAPD маркеров. Результаты выявленного полиморфизма показаны на рисунках.

1 2 3 4 5 6 М 7 8 9 10 11 12

Рис. 1 RAPD спектры с использованием праймеров OPА 04, соответственно. 1 – 31- 40 , 2 – 68, 3 – 11-20, 4 – 70, 5 – 66, 6 – 67, 7 – 49, 8 – 1-10, 9 – Д39, 10 – Д17, 11 – Д15 , 12 – 69.

При рассмотрении рисунка 1, необходимо отметить, что образцы 7, 9, 11, 12 имеют фрагменты длиной 250 п.н. Образцы 1, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12 с праймером ОРА 04 образуют специфические продукты реакции длиной 500 п.н. Образец 8 имеет ампликон длинной 750 п.н. Образцы 1, 12 при проведении полимеразно-цепной реакции с праймером ОРА 04 дают специфический фрагмент длинной 1000 п.н.

1 2 3 4 5 6 М 7 8 9 10 11 12

Рис.2 RAPD спектры с использованием праймеров OPН 07 соответственно. 1 – 31-40 , 2 – 68, 3 – 11-20, 4 – 70, 5 – 66, 6 – 67, 7 – 49, 8 – 1-10, 9 – Д39, 10 – Д17, 11 – Д15 , 12 – 69.

Стратегия применения молекулярных маркеров имеет в виду единственную конечную цель - выявить, визуализировать полиморфизм последовательности ДНК в изучаемой группе организмов.

Анализируя рисунок 2, можно сделать вывод о том, что образцы 6, 7, 8 в результате полимеразно-цепной реакции с RAPD праймером ОРН 07 образуют фрагменты длиной 250 п.н. Ампликон длинной 500 п.н. имеет образец под номером 7. Специфические фрагменты реакции длинной 750 п.н. обнаруживаются у образцов 1, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12. У образцов 1, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 выявляются амплификоны длинной 1000 п.н.

1 2 3 4 5 6 М 7 8 9 10 11 12

Рис.3 RAPD спектры с использованием праймеров OPD 05 соответственно. 1 – 31-40 , 2 – 68, 3 – 11-20, 4 – 70, 5 – 66, 6 – 67, 7 – 49, 8 – 1-10, 9 – Д39, 10 – Д17, 11 – Д15 , 12 – 69.

Отрицательно заряженная ДНК начинает двигаться в геле от минуса к плюсу. При этом более короткие молекулы ДНК движутся быстрее, чем длинные. На скорость движения ДНК в геле влияет концентрация агарозы, напряженность электрического поля, температура, состав электрофорезного буфера и, в меньшей степени, ГЦ-состав ДНК. Все молекулы одного размера движутся с одинаковой скоростью.

При рассмотрении рисунка 3, можно сделать заключение, что полимеразно-цепная реакция с праймером OPD 05 не принесла ожидаемых результатов. Только у образцов 7, 8 наблюдаются специфические фрагменты длиной 1000 п.н., и у образцов 4, 5 выявляются ампликоны длинной 1200 п.н.

1 2 3 4 5 6 М 7 8 9 10 11 12

Рис.4 RAPD спектр с использованием праймера OPС 10

Анализ данных, представленных на рисунке 4, показывает, что при использовании праймера OPС 10 только образец 7 имеет наиболее легкий фрагмент длинной 125 п.н. Более тяжелые специфические фрагменты длиной 500 п.н выявляются у образцов 1, 8, 9, 11, 12. Ампликоны длинной 750 п.н. наблюдаются у образцов 1, 2, 3, 4, 8, 9. Наиболее тяжелые специфические продукты реакции с праймером ОРС 10 длинной 1000 п.н. образуются у образцов 1, 3, 4. Полиморфизм фрагментов ДНК амплифицированных неспецифическими праймерами может быть вызван нуклеотидной заменой в цепи ДНК в участке посадки праймера или вставками и делециями внутри амплифицируемого участка полинуклеотидной цепи. RAPDs относятся к доминантному типу маркеров, гетерозиготные индивидуумы имеют тот же ДНК-спектр, что и доминантный родитель, что является недостатком данного класса генетических маркеров. В том случае если ДНК-спектры являются идентичными для нескольких индивидуумов, это говорит о том, что амплифицированные фрагменты совпадают по размеру, но нет уверенности в том, что сиквенс этих фрагментов также совпадает.

ВЫВОДЫ

1. Наименьший полиморфизм исследуемые образцы проявляют с праймером OPD 05, нуклеотидная последовательность которого не удовлетворяет нашим требованиям

2. Наиболее полиморфными с праймером OPA 04 являются образцы 1, 8 , 12, которые являются результатом селекции кафедры генетики КБГУ.

3. С праймером OPA 07 наибольший полиморфизм показывают образцы 6, 7, 8, остальные исследуемые образцы практически не отличаются друг от друга.

4. Мутантные линии селекции кафедры генетики КБГУ, полиморфны по сравнению с линиями из мировой коллекции ВИР и, в значительной степени, проявляют полиморфизм между собой.

5. Для повышения разрешающей способности и более глубокого изучения полиморфизма между исследуемыми образцами, требуется проведение ПЦР с другими типами праймеров.