7. Методы определения активности инвертазы

Инвертаза (В-фруктофуранозидаза, сахароза), гидролизует сахарозу на глюкозу и фруктозу, разрывая связь, находящуюся у В-глюкозидного углеродного атома остатка фруктозы в молекуле сахарозы. Она действует на гликозидные соединения и, кроме сахарозы, гидролизует рафинозу, генцианозу и стахиозу; катализирует также фруктотрансферазные реакции.

Инвертаза широко распространена в природе, она имеется у многих микроорганизмов, встречается почти во всех типах почв (донных осадков). Ее активность является характерным показателем типов почв (донных осадков) и их биологической активности.

Определение активности инвертазы основано на учете восстанавливающих сахаров, образующихся при расщеплении сахарозы. Этот метод нашел широкое применение и может быть использован для определения инвертазы в образцах почвы (донных осадков) с широким диапазоном активности фермента и концентрации субстрата. Фотоколориметрический и поляриметрический методы более требовательны к концентрации сахаров и неприемлемы для почв (донных осадков) с высоким содержанием органических веществ ввиду окрашенных растворов почвенных экстрактов (донных осадков). Поэтому применение указанных методов в почвенных (донных осадках) исследованиях ограничено.

Материалы и оборудование:

• 5 %-ный р-р сахарозы;

• ацетатный буфер (рН 4,7);

• толуол;

• раствор Фелинга (раствор а — 40 г сернокислой меди растворяют в дистиллированной воде и доводят до 1 л;

• раствор б — 200 г сегнетовой соли растворяют в дистиллированной воде, прибавляют 150 г КОН или NаОН и доводят до 1 л. Оба раствора фильтруют (перед употреблением растворы а и б смешивают в соотношении 1:1).

Ход анализа:

Предварительно в разных районах г. Санкт - Петербурга отбирают образцы почвы (донных осадков) из верхнего горизонта, подверженного разной степени антропогенной нагрузке. В колбу емкостью 50 мл помещают 5 г почвы (донных осадков), добавляют 10 мл 5 %-ного раствора сахарозы, 10 мл ацетатного буфера (рН 4,7) и 5–6 капель толуола. Колбы закрывают пробками, встряхивают и помещают в термостат при температуре 30 °C на 24 ч, периодически встряхивая их. Контроль - стерилизованная почва (3 ч при 180 °С) и чистый субстрат. Из фильтрата, полученного вышеописанным методом, берут 6 мл, в большие пробирки добавляют 3 мл раствора сегнетовой соли и 3 мл раствора сернокислой меди, хорошо перемешивают и кипятят на водяной бане 10 мин. Затем центрифугируют 5 мин при 3000 об/мин.

Фильтрат колориметрируют при 630 нм, кюветы шириной 1 см.

Активность инвертазы выражают в миллиграммах на 1 г почвы (донных осадков) за 1 ч.

Полученные результаты обработать статистически, проанализировать итоги биометрической обработки и сделать вывод.

8. Определение активности уреазы (карбамид-аминогидролазы)

К ферментам, участвующим в превращении белковых веществ, относится уреаза. Образовавшийся в результате уреазной реакции аммиак служит источником питания растений.

Активность уреазы — один из важнейших показателей биологической активности почв (донных осадков). Уреаза катализирует распад мочевины на аммиак и углекислоту.

Фермент обладает строгой специфичностью действия: расщепляет только мочевину и не действует на производные. Оптимум рН уреазы близок к 7,0, но может смещаться в зависимости от концентрации мочевины, от природы и концентрации применяемых буферов. В почве (донных осадках) уреаза может действовать в сравнительно широком диапазоне рН.

Материалы и оборудование:

• Фосфатный буфер (рН 6,7);

• 10 %-ный раствор мочевины;

• 1 н КС1;

• реактив Неслера;

• раствор сегнетовой соли (калий-натрий виннокислый: 50 г соли растворить в 100 мл дистиллированной воды);

• стандартный раствор: 0,1 мг NН₃ в 1 мл воды.

Ход анализа:

К 2 г почвы (донных осадков) добавляют 5 мл фосфатного буфера (рН 6,7) и 5 мл 10 %-ного раствора мочевины. После этого колбы тщательно встряхивают и инкубируют 3 часа при 30 °С или 24 часа при 25 °С. После добавляют 7,5 мл КС1, перемешивают и центрифугируют 10 мин при 3000 об / мин. Центрифугат сливают в пробирки. Далее по 1 мл центрифугата переносят в мерные колбы на 25 мл, добавляют в колбы воду (5–7 мл), тщательно перемешивают и снова добавляют небольшой объем воды, после чего вливают 1 мл раствора Неслера и 1 мл 50 %-ного раствора сегнетовой соли. Доводят до метки осторожным приливанием небольших объемов воды при тщательном перемешивании. Оптическую плотность измеряют при длине волны 480 нм в кюветах шириной 20 мм. Активность уреазы выражается в миллиграммах NН3 на 10 г почвы (донных осадков) за сутки и рассчитывается по формуле:

NH₃ =(a −b) х p х10 / H,

где a — количество аммиака в пробе по графику, мг;

b — количество аммиака в контроле по графику, мг;

p — разведение;

H —навеска почвы, г.

Полученные результаты обработать статистически и сделать вывод.