Вопрос 74. Генно—инженерные методы выделения генов.
ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ, генетическая инженерия — раздел молекулярной биологии, связанный с целенаправленным конструированием новых, не существующих в природе сочетаний генов с помощью генетических и биохимических методов. Генная инженерия открывает новые (не всегда бесспорные) пути решения проблем генетики, медицины, сельского хозяйства, биотехнологии. Суть новой технологии заключается о направленном, по заранее заданной программе конструировании молекулярных генетических систем вне организма (in vitro) с последующим внедрением созданных конструкций в живой организм. В результате достигается их включение и активность в данном организме и у его потомства. Возможности генной инженерии – генетическая трансформация, перенос чужеродных генов и других материальных носителей наследственности в клетки растений, животных и микроорганизмов, получение генно-инженерно-модифицированных (генетически модифицированных, трансгенных) организмов с новыми уникальными генетическими, биохимическими и физиологическими свойствами и признаками, делают это направление стратегическим. Список биологически активных веществ для медицины и промышленного производства весьма обширен. В их числе инсулин, гормоны роста, интерферон, вакцина против гепатита В, вакцина против ящура и многие другие.
Генная инженерия решает такие задачи, как:
- получение рекомбинантных ДНК и РНК;
- получение генов путем выделения их из клеток или синтеза;
- клонирование генов;
- введение генов в клетку и синтез чужеродного ей белка.
Выделение генов
Первый подход - это выделение из генома участка ДНК, представляющего нуклеотидные последовательности определенного гена. Этот процесс возможен благодаря специальм ферментам- рестриктазам. При помощи этих ферментов ДНК генома разрезается в определенных точках (сайтах рестрикции). В дальнейшем среди этих фрагментов ДНК различными молекулярными методами проводится поиск последовательностей, наиболее полно соответствующих полноразмерному гену. Второй подход – выделение из клетки матричной РНК. Далее при помощи обратной транскриптазы нарабатывают комплементарные ДНК (кДНК) , из которых выделяют последовательности ДНК, соответствующие экспрессирующимся в данное время в клетке генам.
Существуют и другие подходы к выделению генов: использование мобильных элементов (транспозонов), метод «прогулки по хромосомам», метод использования гомологичных генов и т.п. Все эти подходы объединяет одно – все они трудоемки.
Для сохранения и реплицирования выделенных генов их клонируют в плазмиды. Плазмида – это кольцевая молекула ДНК, которую наряду с хромосомой несут бактериальные клетки и которая реплецируется независимо от бактериальной хромосомы. Используя ферменты рестриктазу(расщепляет плазмиду в отдельных местах) и лигазу (сшивает разрезанную плазмиду), ген или его часть встраивают в плазмиду. Респликация плазмид позволяет нарабатывать гены в необходимых для генно-инженерных работ количествах.
Вопрос 75. Трансформация. Типы векторов, Безвекторные системы.
Трансформация – непосредственный перенос гена в чужеродный геном.
Система, обеспечивающая такой перенос, получила название вектора.
Плазмидные векторы.
В качестве векторов используются плазмиды бактерий, и для трансформации растений чаще всего Ti-плазмида почвенной бактерии Agrobakterium tumefaciens. В природе A. tumefaciens проникают в клетки корней растений и там размножаются. При этом часть плазмидной ДНК (Т-ДНК) встраивается в хромосомы поврежденных (зараженных) клеток, индуцируя образование галлов (опухолей).
При трансформации используют разоруженную Ti-плазмиду, без онкогенов, вызывающих образование галлов. Вместо них встраивают нужные исследователю гены и плюс репортерные гены, подтверждающие о встраивании Т-ДНК в геном растения. Это гены неомицинфосфотрансферазы II (NRTII), дигидрофолатредуктазы,гигромицинфосфотрансферазы(НРТ), в результате экспрессии которых трансформированная клетка становится устойчивой к антибиотикам канамицину, мететрексиату и гигромицину В. При культивировании трансформированных клеток на среде с данным антибиотиком выживают только клетки, у которых Т-ДНК включена в геном. Помимо встроенных генов Ti-плазмида должна содержать гены vir-областей (vir А, vir В, vir С, vir D, vir G), обеспечивающих сам процесс встраивания Т-ДНК в хромосому. Была создана бинарная система трансформации, состоящая из небольшой , реплицирующейся как в E.coli, так и в
tumefaciens, плазмиды (5-10 тыс. п.н.), несущей переносимые гены, и Ti-плазмиды, несущей vir-гены с делетированной Т-ДНК.
С использованием A. tumefaciens легче трансформировать двудольные растения (горох, табак и т.п.), чем однодольные (пшеница, кукуруза). Но это зависит от метода трансформации. К настоящему времени создано огромное число плазмид, которые используются в качестве векторов при трансформации, как растений, так и животных.
Вирусные векторы.
При трансформации растений используют и векторы, сконструированные на основе растительных вирусов. Но их набор ограничен, так как у большинства растительных вирусов генетическим материалом является РНК, и только у некоторых из них, таких , как вирус мозаики цветной капусты (CaMV) и группы вирусов Gemini, наследственным материалом служит ДНК. Недостаток вирусных векторов – ограниченная протяженность встраиваемых генов (от 200 до 500 п.н.) и высокая специфичность по отношению к видам растений. Так, вирус мозаики цветной капусты можно использовать только при трансформации растений, относящихся к семейству крестоцветных.
Безвекторные системы.
Генная пушка.
Этот метод носит название биологической баллистики. Он заключается в обстреле из вакуумной пушки (генная пушка) суспензий клеток растений, протопластов и каллусов. Обстрел растительных целей (тканей) производят частицами золота или вольфрама (диаметр 0,6-1,2 мкм), на которые напылена чужеродная ДНК. Растительные клетки располагают на специальной целлофановой пластине, Частици металла пронизывают клетки, оставляя в них ДНК. Трансформируется при этом около 10-15% клеток, часть из которых регенерирует в нормальные растения. Хотя процесс трансформации носит случайный характер, к настоящему времени этим способом получены трансгенные растения, преимущественно однодольных культур(кукурузы, риса, пшеницы и др.).
Схематическое
изображение генной пушки.
Метод электропорации.
Это один из методов прямого введения ДНК в клетку. Растительные клетки погружают в среду с находящейся в ней чужеродной ДНК. Через эту среду пропускают (доли секунды) электрический ток напряжением 250-300 В. Через расширившиеся поры ядерной мембраны чужеродная ДНК проникает в ядра и включается в хромосомы.
Метод микроиньекции.
С помощью микроигл (наружный диаметр 2мкм) чужеродную ДНК вводят в ядра клеток, закрепленных на стекле при помощи полилизина.
Использование «агентов слияния».
В качестве «агентов слияния» используют положительно заряженные сферы липидов (липосомы), которые обволакивают векторную ДНК , защищая ее от действия нуклеаз. Находящаяся в липосомах ДНК проникает с их помощью в растительные клетки и включается в геном.