Вопрос 72. Структура гена у эукариот.

Главная количественная особенность генетического материала эукариот – наличие избыточной ДНК. Этот факт легко выявляется при анализе отношения числа генов к количеству ДНК в геноме бактерий и млекопитающих. Если средний размер гена бактерий 1500 пар нуклеотидов (п.н.), а длина кольцевой молекулы ДНК хромосомы Е. coli и В. subtilis составляет свыше 1 мм, то в такой хромо­соме могут разместиться около 3 тысяч генов. Примерно такое число генов было экспериментально определено у бактерий по числу типов иРНК. Если это число умножить на средний размер гена, то получится, что около 95% генома бактерий состоит из кодирующих (генных) последовательностей. Остальные 5%, по-видимому, заняты регуляторными элементами. Иная картина наблюдается у эукариотических организмов. Например, у человека насчитывают приблизительно 50 тысяч генов (имеется в виду только суммарная длина кодирующих участков ДНК – экзонов). В то же время размер генома человека 3×10⁹ (три миллиарда) п.н. Это означает, что кодирующая часть его генома составляет всего 15…20 % от тотальной ДНК. Существует значитель­ное число видов, геном которых в десятки раз больше ге­нома человека, например некоторые рыбы, хвостатые амфибии, лилейные. Избыточная ДНК характерна для всех эукариот. В этой связи необходимо подчеркнуть не­однозначность терминов генотип и геном. Под генотипом следует понимать совокупность генов, имеющих фенотипическое проявление, тогда как понятие генома обозначает количество ДНК, находящееся в гаплоидном наборе хро­мосом данного вида.

Таким образом, молекулярная структура генов у эукариот оказалась значительно сложнее, чем у прокариот. Протяженность эукариотических генов значительно больше , чем прокариотических. При этом, каждый ген состоит из участков ДНК, кодирующих синтез определенных клеточных продуктов (белки, различные РНК и т.п.), и участков ДНК, которые не несут генетической информации, а как бы разделяют отдельные участки, Первые участки получили название экзонов, а вторые-интроновю Число экзонов и интронов индивидуально для каждого гена. По протяженности экзоны короче. Такое строение структурных генов определяет особенность процесса синтеза мРНК, а также различие этого процесса у прокариот и эукариот.

При образовании мРНК транскрибируются все участки экзонов и интронов и образуется молекула про-мРНК. Затем внутриядерная органелла сплайсиосома определяет границы между интронами и экзонами, вырезает участки, транскрибированные с интронов, и соединяет участки, транскрибированные с экзонов. Этот процесс называется сплайсингом. Затем, зрелая мРНК переходит из ядра в цитоплазму.

Очень важным стало открытие явления, получившего название альтернативного сплайсинга. Оно заключается в том, что с одного гена считывается более одного типа мРНК. Механизмы этого явления пока недостаточно ясны.

Вопрос 73. Процессинг рнк.

у прокариот

Это процесс созревания, при котором первичный РНК-транскрипт модифицируется и превращается в зрелую РНК. Характер и степень модификации РНК зависят от типа РНК.

Молекула мРНК у прокариот не подвергается процессингу. У некоторых бактерий транскрипция и трансляция сопряжены, т.е. происходят одновременно. 5`-конец мРНК может транслироваться на рибосоме и затем подвергаться деградации еще до завершения синтеза ее 3`-конца.

Молекулы тРНК вначале синтезируются в виде протРНК, которая примерно на 20% длиннее, чем соответствующая тРНК. Лишние последовательности, расположенные у 5`и 3`-концов, удаляются с помощью таких ферментов, как рибонуклеаза Q и P .Иногда молекула протРНК состоит из двух или более молекул тРНК, соединенных между собой . Их разделение также осуществляется с помощью рибонуклеаз. Если 3`-конец тРНК не несет концевой последовательности ЦЦА, то эти основания присоединяются при постсинтетической модификации . Все тРНК содержат минорные основания. Эта модификация происходит после завершения транскрипции.

Гены рРНК прокариот расположены в транскрипционных блоках. Три гена рРНК E.coli (16S, 23S, 5S) располагаются вместе с генами нескольких тРНКв одном таком блоке и транскрибируются в виде одной молекулы РНК. Эти молекулы рРНК и тРНК отделены друг от друга спейсорной РНК. Ращипление первичного транскрипта на отдельные составляющие катализирует рибонуклеаза Q; поскольку этот фермент специфичен к двуцепочечной РНК, предполагают, что в области спейсеров образуются двухцепочечные шпильки , которые фермент узнает и вырезает.

или

Транскрипты РНК, синтезированные при помощи РНК-полимеразы, претерпевают дальнейшие ферментативные превращения, называемые посттранскрипционным процессингом, и только после этого они обретают свою функциональную активность. р-РНК и т-РНК синтезируются в виде более длинных предшественников, которые затем модифицируются и расщепляются с образованием конечных продуктов. Транскрипты эукариотических мРНК также подвергаются процессинггу, тогда как у прокариотических мРНК он отсутствует.

Этот предшественник метилируется по специфическим основаниям и расщепляется, давая 17S- и 25S-промежуточные РНК, которые затем процессируются путем отщепления остатков с помощью нуклеаз, образуя характерные для прокариот 16S- и 23S-р-РНК (рис. 18). 5S-р-РНК образуется отдельно из 3 -концевого участка 30S-предшественника.

Процессинг («созревание») транскрипта р-РНК у прокариот.

У эукариот 18S- и 28S-р-РНК образуются в несколько этапов: из большой 45S-прерибосомной РНК. Процессинг протекает в ядрышке. Сначала происходит метилирование более чем 100 нуклеотидов 45S-предшественника (рис. 19). Затем метилированная 45S-РНК претерпевает ряд ферментативных расщеплений, приводящих в конечном итоге к появлению 18S-, 28S- и 5,8S-р-РНК, характерных для эукариотических рибосом. 5S-р-РНК синтезируется отдельно.

тРНК также образуются из более длинных РНК-предшественников в результате ферментативного удаления лишних нуклеотидов с 5 - и 3 -концов молекулы. В некоторых случаях из одной длинной молекулы-предшественника в результате ферментативного расщепления образуются две и даже большее число разных т-РНК.

В ходе процессинга в предшественниках т-РНК происходят изменения двоякого рода. Во-первых, к некоторым т-РНК присоединяется 3 -концевая тринуклеотидная последовательность -С-С-А (3 ); в других т-РНК этот 3 -концевой тринуклеотид уже содержится в транскрипте. 3 -концевой остаток А представляет собой именно ту часть молекулы т-РНК, с которой ковалентно связывается соответствующая ей аминокислота перед включением в растущую полипептидную цепь на рибосоме. Во-вторых, ряд оснований в т-РНК специфическим образом модифицируется: одни метилируются, другие дезаминируются, третьи восстанавливаются. Модифицированные основания располагаются во всех т-РНК в определенных положениях.

Процессинг предшественников м-РНК у эукариот представляет собой очень сложный процесс. Эукариотические м-РНК, обнаруживаемые в цитоплазме, обладают тремя отличительными структурными свойствами. Первое из них состоит в том, что эукариотические м-РНК явяляются обычно моногеннми молекулами, в то время как многие прокариотические м-РНК – полигенны. Второе характерное свойство большинства эукариотических м-РНК заключается в том, что они содержат на своем 3 -конце «хвост» из 100-200 последовательно присоединенных остатков А – так называемый поли (А) – хвост. Этот хвост синтезируется отдельно из молекул AТP с помощью полиаденилатполимеразы, которая работает в основном также, как РНК-полимераза, и катализирует реакцию:

 

Полиаденлатполимеразе не нужна матрица, однако необходимо м-РНК в качестве затравки. Третья отличительная особенность большинства эукариотических м-РНК – это наличие в них 5 -концевого «кэпа» (от англ. cap-«шапка»), представляющего собой остаток 7-метил-гуанозина, присоединенный к 5 -концевому остатку м-РНК посредством трифосфатной связи (рис. 20). Функции «кэпа» и поли (А) – хвоста точно неизвестны. «Кэп», возможно, принимает участие в связывании м-РНК с рибосомой, инициируя процесс трансляции. Не исключено также, что «кэп» иполи (А) – хвост предохраняют м-РНК от ферментативного разрушения.

 В эукариотическом ядре мРНК должны пройти дальнейшие стадии процессинга, заключающиеся в удалении интронов. В ядре присутствуют РНК особого класса, которая при синтезе белка очень быстро обновляется. Эта РНК носит название гетерогенной ядерной РНК (гяРНК) и состоит из смеси очень длинных молекул РНК-предшественников, состоящих из кодирующих белок участков экзонов и некодирующих участков – интронов. Удаление интронов при процессинге предшественников мРНК протекает следующим образом (рис. 21).

 Нуклеотидная последовательность мяРНК (состоящих примерно из 100 нуклеотидов) комплементарна последовательностям на концах каждого из интронов. В результате спаривания оснований, содержащихся в мяРНК, и концах свернутого в петлю интрона, последовательности двух экзонов сближаются таком образом, что становится возможным удаление разделяющего их интрона и ферментативное соединение (сплайсинг) кодирующих фрагментов (экзонов). Таким образом, молекулы мяРНК играют роль временных матриц, удерживающих близко друг от друга концы двух экзонов для того, чтобы сплайсинг произошел в правильном месте.

После того как из РНК удаляются все интроны и завершается процессинг предшественника мРНК, зрелая мРНК покидает ядро. Чтобы сделать это мРНК сначала связывается с двумя специальными белками, которые проводят мРНК в цитоплазму сквозь поры в ядерной оболочке. Эти поры пропускают из ядра, по-видимому, только полностью «созревшие» мРНК. Обрывки РНК, оставшиеся после процессинга, расщепляются нуклеазами. Образовавшиеся при этом нуклеозид-5 -монофосфаты переводятся с помощью АТР в нуклеозид - 5 - трифосфаты и вновь используются для синтеза РНК в ядре.

Процессинг транскриптов эукариотических р-РНК