7.Методы лабораторной диагностики энтеровирусных инфекций: вирусологический, серологический (рск, реакция нейтролизации)

Лабораторную диагностику нужно вести одновременно на все вирусы, так как они вызывают однотипные заболевания.

Вирусологический метод: заражают хлопковых мышей (на вирус Коксаки) выращивают вирус на культуре ткани, заражают новорожденных мышей, и если они погибают, то ищут вирус. На культуре ткани определяют присутствие вируса по наличию цитопатического действия, цветной пробе Солка. Идентификация вируса осуществляется в иммунологических реакциях, построенных по принципу антиген-антитело: в реакции нейтрализации. Положительный результат реакции нейтрализации будет определяться по отсутствию феноменов цитопатического действия, цветной пробы и т.д.

Серологический метод. Определяют нарастание титра антител в парных сыворотках. Берется известный антиген, известный вирус соединяются с сывороткой больного и ищем будут ли нейтрализовать вирус и опять исчезнут все феномены его присутствия в культуре ткани или не лабораторном животном.

Материал для исследования

Материалом для исследования служат испражнения больных в течение первой недели, смывы из носоглотки не позднее третьего дня, кровь, ликвор, моча не позднее пятого дня, сыворотка крови в первый и 14 дня; в случае смерти - кусочки мозга, внутренних органов, лимфоузлы. Ма­териал берут в первые часы болезни, от трупа — не позднее чем через 3—4 ч после смерти.

Материалом для исследования служат кровь, сыворотка, содержимое везикул, асцитическая жидкость. От трупа берут на исследование кровь, спинномозговую жидкость, ткань спинного и продолго­ватого мозга, варолиева моста, кусочки кишок и их содержимое, кусочки печени, селезенки, легкого, подже­лудочной железы, миокарда, лимфатические узлы.

Кровь (около 10 мл) для вирусологического анализа и приготовления сыворотки берут натощак в начале болезни, а затем спустя 3—4 недели.

Стул берут в пенициллиновые флаконы, эмульгируют в растворе Хэнкса, центрифугируют и добавляют эфир и антибиотики. Фекалии (4—6 г) собирают с интервалом 1—2 дня (можно использовать флаконы из-под антибиотиков). Готовят 10 % суспензию в растворе Хенкса, встряхивают и осветляют центрифугированием в течение 30 мин при 3000 об/мин (при возможности материал центрифугиру­ют при 10 000 об/мин). Надосадочную жидкость обра­батывают эфиром  (к осветленной суспензии фекалыий добавляют 50 % по объему диэтилового эфира, смесь оставляют в холодильнике под ватно-марлевой пробкой в течение 12-16 часов)  и антибиотиками.

Ректальные тампоны помещают в пробирку с 1—2 мл раствора Хенкса или Эрла, споласкивают, отжимают. Материал центрифугируют и обрабатывают эфиром и антибиотиками.

Смывы из носоглотки получают путем двукратного полоскания горла стерильным физиологическим раствором хлорида натрия, освещают центрифугированием и обрабатывают эфиром и антибиотиками. Глоточный смыв в объеме 20 мл получают при 2-кратном (с интервалом 3 мин) полоскании горла стерильным солевым раствором или дистиллированной водой. Тампонами протирают заднюю стенку глотки, миндалины и небные дужки и погружают в пробирку с 1—2 мл раствора Хенкса. Материал центрифугируют и обрабатывают эфиром и антибиотиками.

Среднюю порцию мочи (10 мл) также обрабатывают пенициллином и стрептомицином. Кровь и ликвор используют для вирусологических исследований без предварительной обработки. Секционный материал эмульгируют в стерильных ступках с песком, готовят 20% суспензию в растворе Хэнкса, центрифугируют и добавляют антибиотики

Стерильную прозрачную спинномозговую жидкость (около 3 мл) используют для выделения вируса без предварительной обработки. Мутную спинномозговую жидкость, а также содержащую эритроциты центрифу­гируют. Мочу в объеме 10 мл берут в стерильный сосуд в середине акта мочеиспускания и обрабатывают анти­биотиками.

Пробы секционного материала растирают в стериль­ной ступке, готовят 20 % суспензию в растворе Хенкса, центрифугируют 5—10 мин при 2000 об/мин.

Материал обрабатывают  антибиотиками — пенициллином (1000 ЕД/мл) и стрептомицином (500 ЕД/мл) в течение 2 ч при комнатной температуре, а затем используют его для выделения вируса. Часть материала замораживают и хранят при температуре —70 °С. Мно­гократное замораживание и оттаивание недопустимо, так как приводит к инактивации вируса.

Вирусологические исследования

Вид исследова­ния	Цель исследо­вания	Материал	Живая система для заражения	Культивируемый энтеровирус	Способ идентификации
Вирусологическое	Выделение и идентификация вируса	Клинический    материал: фекалии (ректальные тампоны),  смывы  с носовой части  глотки  (тампоны), спинно-мозговая        жидкость,   кровь,   содержимое везикул, моча, асцитическая жидкость	Первичные   культуры клеток почек обезьян, фибробластов эмбриона  человека,  переви- ваемые культуры клеток Vero, Hela, Hep-2, KB и др.	Полиовирусы   1-        3-го типов, Коксаки В 1-6-го   типов,    вирусы ECHO, Коксаки А (непостоянно)	РН  со   смесями поливалентных сывороток   в культурах  клеток и на мышах-сосунках;     типовая   принадлеж-ность вируса в РН с моновалентной  сывороткой; РПГ, РИФ, РСК
		Секционный материал: кровь,      спинномоз-говая жидкость, кусочки спинного,        продолговатого мозга,  варолиева  моста, кусочки     и  содержимое кишок	Культура клеток	Вирусы  Коксаки А и другие энтеровирусы	РПГ с эритроцитами человека 0 (I) группы крови, некоторые типы  энтеровирусов   (непостоянно)
		При  подозрении  на   инфекции, вызванные ECHO и Коксаки — кусочки внутренних органов,  печени, селезенки, легкого, миокарда, лимфати-ческие узлы	Однодневные    мыши-сосунки	Вирусы        Коксаки групп А и В	Данные патоморфологического исследования

 Полиовирусы (1—3-й), большинство вирусов Коксаки В, ECHO, некоторые типы вирусов Коксаки А (7-й, 9-й, 14-й, 16-й, 21-й) при размножении в культуре клеток по­чек обезьян оказывают ЦПД. В культуре клеток почек эмбриона человека, амниона человека, диплоидных клет­ках WI-38 репродуцируются вирусы Коксаки А (11-й, 13-й, 15-й, 18-й, 20-й, 21-й, 24-й), ECHO (21-й, 34-й). Боль­шинство серотипов Коксаки А размножаются и вызыва­ют ЦПД в культуре клеток RD (культура из рабдомиосаркомы человека). Для выделения вирусов Коксаки параллельно с культурами клеток заражают новорож­денных мышей.

Вирусы Коксаки А из материала от больных наиболее успешно удается выделить только на однодневных мы­шах-сосунках, так как они не размножаются в большин­стве культур клеток обезьян и человека.

Мышей-сосунков заражают в мозг (0,01 мл), под­кожно (0,03 мл), внутрибрюшинно (0,05 мл) или ком­бинированным методом,. За инокулированными живот­ными наблюдают 14 дней. При развитии клинических симптомов из мозга больных животных и тушек готовят 20 % суспензию для дальнейшего пассирования вируса. Берут также кусочки тканей для гистологического иссле­дования.

Индикацию энтеровирусов проводят по ЦПД и бляшкообразованию под агаровым или бентонитовым  покрытиями, в культуре клеток, развитию пара­личей у мышей-сосунков и их гибели, а также по физи­ко-химическим свойствам: небольшие размеры, резистент-ность к жирорастворителям и низким значениям рН (3,0), термостабильность при температуре 50 °С в при­сутствии 1 М MgCl₂ (магния хлорида).

Для идентификации энтеровирусов применяют РН, РТГА, РСК, РПГ, РИФ с типоспецифическими иммун­ными сыворотками.

РН проводят в культуре клеток или на мышах-сосун­ках по общепринятой методике.

Идентификацию штаммов вирусов Коксаки А. В и ECHO, обладающих гемагглютинирующими свойствами, осуществляют с помощью РТГА с использованием анти­генов из зараженных клеточных культур и 1 % взвеси эритроцитов человека группы 0(І).

Для РСК вместо антисывороток применяют иммун­ную асцитическую жидкость мышей, обладающую мень­шей антикомплементарностью.

РПГ дает хорошие результаты с антигеном, концент­рированным в 200—400 раз.

Для концентрации энтеровирусов применяется бентонитовый ме­тод. К 500 мл культуральной вируссодержащей жидкости добав­ляют 0,05—0,1 % геля бентонита по сухому весу сорбента, рН сме­си доводят до 3,5—4,0 0,1 N раствором НС1. Смесь встряхивают 3—5 мин, центрифугируют при 2000—3000 об/мин в течение 10— 15 мин. Осадок (вирус-бентонит) отмывают 20—40 мл дистиллиро­ванной воды. Элюцию вируса осуществляют 0,05 М раствором трис-буфера (рН 9,0) при интенсивном встряхивании в течение 4— 5 мин. После этого смесь центрифугируют и исследуют надосадочную жидкость, в которой находится вирус. Этот метод позволяет сконцентрировать вирус в 100—200 раз.

Для серологической диагностики

применяют РН, РСК, РТГА. Диагностическое значение имеет 4-кратное и более увеличение титра антител. Результаты сероло­гического исследования необходимо сопоставить с виру­сологическими, эпидемиологическими и клиническими данными.

Для проведения РН смешивают 100 доз вируса с 2-кратными разведенными сыворотками больного. При проведении РН в культурах клеток результаты учиты­вают на 3—4-й и 7—8-й день, на мышах-сосунках — на 10—14-й день.

РСК используют для диагностики полиомиелита. Диагностическое значение имеет выявление антител в титре 1 : 32 и выше, а также увеличение титра антител в 4 раза и более. Лучшие результаты дают непрогретые (малореактивные) антигены, полученные путем одно­кратного замораживания и оттаивания инфицированных клеток после наступления полной специфической дест­рукции.

РТГА для серологической диагностики энтеровирусных инфекций применяется редко. Гемагглютинирующий антиген получают при высоком титре вируса (10⁶ — 10⁷ ЦПД₅₀/МЛ). Сыворотки больных обрабатывают для удаления спонтанных гемагглютининов и неспецифиче­ских ингибиторов гемагглютинации.

 Описано применение РИФ для исследова­ния клеток спинномозговой жидкости. При ротавирусных инфекциях применяют ЭМ и ИЭМ (см. с. 243).

.