Методика постановки микрореакции

Постановка микрореакции с испытуемой плазмой и инактивированной сывороткой крови возможна в качественном и количественном вариантах. При использовании качественной методики постановки микрореакции автоматической пипеткой забирают по 90 мкл плазмы или инактивированной сыворотки крови и вносят в лунки, куда затем добавляют по 30 мкл эмульсии кардиолипинового антигена. В каждую лунку вносят плазму или сыворотку крови от одного обследуемого и нумеруют соответственно списку в регистрационном журнале. Ингредиенты перемешивают встряхиванием пластины во встряхивателе (100 качаний в 1 минуту) в течение 5 минут, затем в каждую лунку добавляют по 90 мкл изотонического раствора натрия хлорида, перемешивают покачиванием пластины и оставляют при комнатной температуре на 5 минут (оптимальный температурный режим реакции 23-28град.). Результаты учитывают только после появления хлопьев в контрольной слабоположительной сыворотке крови.

При использовании количественной методики постановки микрореакции в 9 лунок горизонтального ряда пластины, начиная со второй лунки, вносят по 90 мкл изотонического раствора натрия хлорида и добавляют в первую и вторую лунки по 90 мкл исследуемой плазмы или сыворотки крови. Содержимое второй лунки перемешивают автоматической пипеткой, забирая его и выпуская из нее в лунку 5-6 раз, затем забирают 90 мкл и переносят в третью лунку. Из третьей лунки 90 мкл переносят в четвертую и т. д. по десятую лунку, из которой 90 мкл удаляют. Таким образом получают двукратные разведения плазмы или сыворотки крови 1:2, 1:4, 1:8 и далее до 1:516. В первую лунку изотонический раствор натрия хлорида не приливают, а вносят только 90 мкл плазмы или сыворотки крови, т.е. исследуют цельную плазму или сыворотку крови. Во все лунки добавляют по 30 мкл эмульсии кардиолипинового антигена. Пластину встряхивают 5 минут, после чего во все лунки добавляют по 90 мкл изотонического раствора натрия хлорида. Через 5 минут регистрируют результаты так же, как при постановке качественной реакции.

Титром преципитинов считают последнее разведение плазмы или сыворотки крови, где обнаружен преципитат. Величина титра указывает на активность процесса, а его снижение во время лечения - на эффективность терапии. Стабильность титров настораживает клиницистов в отношении эффективности терапии, увеличение же их требует пересмотра лечения.

Для получения достоверных результатов следует пользоваться одной и той же серией препарата при обследовании больного в процессе лечения, что относится ко всем реакциям на сифилис.

К моменту снятия леченного больного с учета неспецифические тесты с кардиолипиновым антигеном обычно негативируются, в то время как позитивность специфических реакций может наблюдаться долго после окончания лечения, в связи с чем эти тесты не могут служить критерием излеченности и больные снимаются с учета с положительными результатами РИТ, РИФ, ИФА, РПГА.

Одним из наиболее известных и широко применяемых тестов является разработанный в 1946 г. VDRL, результат которого визуализируют (регис­трируют) при помощи светооптического микроскопа или лупы. Этот тест оказался эффективным при использовании прогретой сыворотки крови, а также образцов спинномозговой жидкости, в отличие от микрореакции пре­ципитации, однако он не пригоден для исследования плазмы крови. Изменение титра в динамике и после лечения, до развития серонегативации, является критерием эффективности терапии и излеченности. Специфичность VDRL близка к ре­зультатам MP (около 98%), чувствительность зависит от формы сифилиса и составляет: при первичном сифилисе - 78%, при вторичном - 100%, при скрытом - 95%, при позднем - 71% (Larsen S.A. и соавт., 1995). VDRL, несмотря на включе­ние его в список нетрепонемных тестов (Приказ МЗ РФ №87), пока не нашел в России широкого применения.

Еще одной модификацией нетрепонемного флоккуляционного теста стал метод определения реагинов в непрогретой плазме - USR-тест, исполь­зуемый при исследовании сыворотки и плазмы крови (Portnoy J. и соавт., 1976). Лимитирующий фактор при использова­нии этой реакции, как и VDRL, - необходимость микроскопической регис­трации результата. Как и USR-тест, VDRL в России не применяют.

Еще одним нетрепонемным тестом, широко используемым за рубежом, а в последние годы и в России, стали быстрый плазмореагиновый тест (RPR - rapid plasma reagin) и аналогичный ему TRUST - toluidin red unheated serum test. Различием этих эффек­тивных тестов является то, что в кардиолипиновый антиген в первом слу­чае добавляют частицы мелкодисперсного угля, а во втором (TRUST), как следует из его названия, - суспензию водонерастворимого толуидинового красного или суданового черного, что значительно облегчает визуализацию результата.

Эти тесты были предложены за рубежом для массового и быстрого ск­рининга образцов сыворотки или плазмы крови в «полевых» условиях, т.е. не требуют лабораторного оборудования. Возможен качественный и, что особенно важно для последующего контро­ля эффективности терапии, количественный учет результата. После адекват­ной, полноценной терапии первичного и вторичного сифилиса титр - послед­нее разведение, в котором обнаруживают положительный результат, - должен снижаться не менее чем в 4 раза через 3-4 месяца, и в 8 раз - после 6-8 месяцев. Специфичность обоих тестов - 90-99%, чувствительность при пер­вичном сифилисе - от 85 до 86%, при вторичном - 100%, при скрытом - 98% (Larsen S. с соавт., 1995).

Следует, однако, учитывать, что оба эти теста неприменимы для исследования спинномозговой жидкости.

Таким образом, в настоящее время созданы высокоэффективные, быст­рые, удобные в работе, обладающие значительной пропускной способностью нетрепонемные флоккуляционные скрининговые тесты, используемые на практике как для первичного обследования на сифилис, так и с целью контро­ля эффективности терапии. Эти методы регламентированы для использования в лабораторной диагностике сифилиса (Приказ МЗ РФ №87), а сами тесты выпускаются в РФ и зарегистрированы официально.

После открытия Вассерманом реакции с липидными антиге­нами началось создание и совершенствование огромного количества методов диагностики сифилиса. Все они были нетрепонемными и основывались на вы­явлении реакций организма больного на внедрение патогенного возбудителя - Т. pallidum. Позже их назвали флоккуляционными: реакции Кана, Закса-Витебского с антигеном Закс-Георги, микрореакция преципитации (МРП), VDRL (Ve­nereal Diseases Research Laboratory), RPR (rapid plasma reagin), USR(unheated serum reagin),TRUST (toluidin red unheated serum test), модификации реакции связывания (фиксации) комплемента (РСК), - реакции Вассермана, как ее называют большинство специалистов.

В 1906 г. А.Вассерман совместно с А.Нейссером и К.Бруком предложили первый серологический метод диагностики сифи­лиса, основанный на феномене связывания комплемента, от­крытом в 1901 г. Ж. Борде и О.Жангу. В качестве антигена был применен спиртовой экстракт из печени мертворожденного пло­да, пораженного сифилитической инфекцией.

Вместе с тем известно, что эта реакция в том виде, в каком ее применяют в России (за рубежом этот метод уже более 30 лет не используют), состоит из двух этапов - исследование сыворотки от пациента с кардиолипиновым антигеном (собственно реакция Вассермана) и исследования трепонемным (культуральным, обработанным ультразвуком) антигеном - соответственно, РСКк и РСКт.

Реакция связывания комплемента с кардиолипиновым антигеном (ре­акция Вассермана) основана на свойстве сыворотки крови больных сифи­лисом, в отличие от сыворотки здоровых людей, образовывать с антигенами комплекс, адсорбирующий комплемент, который выявляют при добавлении индикаторной системы: эритроцитов барана и гемолитической сыворотки.

Реакцию Вассермана, оценивают по степени задержки гемо­лиза, условно обозначая ее активность числом плюсов: 4+ - пол­ная задержка гемолиза, 3+ - выраженная задержка гемолиза, 2+ - частичная задержка, 1+ - слабая задержка, и, соответственно: резко положительный, положительный, слабоположительный, отрицательный результат. Следует учитывать, что задержка гемолиза может быть вызвана следующими причи­нами:

1. недостаточным количеством комплемента и гемолизина, используемых в реакции;

2. слишком высокой концентрацией эритроцитов, а также индивидуальны­ми свойствами эритроцитов барана и сыворотки.

Поскольку реакция Вассермана дает возможность определить лишь нали­чие (или отсутствие) в сыворотке больного сифилисом антител, то определить уровень антител в динамике возможно лишь количественными методами ис­следования. Наибольшее практическое применение получил количественный метод РСК с увеличивающимися разведениями исследуемой сыворотки, кото­рый применяют для контроля эффективности терапии (снижение титра реагиновых антител - негативация серореакций).

Микрореакция и реакция связывания комплемента становятся положительными к концу второй недели первичного периода сифилиса.

Еще раз следует подчеркнуть, что за рубежом для диагностики сифилиса РСК в настоящее время не используется.

Однако скрининговые, быстрые отборочные методы диагностики не решают про­блему постановки диагноза, их используют в комплексе с трепонемными тестами. Другими словами, при положительных, а также при любых сомнительных результатах совершенно необходимо проведение подтвержда­ющих высокоэффективных, специфических трепонемных (диагностических) тестов. К таковым относятся:

• реакция связывания комплемента (РСК) с трепонемным антиге­ном;

• реакция иммунофлюоресценции (РИФ) и ее модификации;

• реакция иммобилизации бледных трепонем (РИБТ или РИТ),

а также относительно новые для России и регламентированные Приказом МЗ РФ №87 (2001 г.):

• иммуноферментный анализ (ИФА - ELISA) и его модификации;

• реакция пассивной гемагглютинации (РПГА - ТРНА) и ее модифи­кации.

Подтверждающие (специфические) реакции используют для подтверждения диа­гноза у лиц с клиническими проявлениями, подозрительными на сифилис; для диф­ференциальной диагностики скрытого сифилиса и ложноположительных серологических реакций; обследования лиц, бывших в половом и тесном бытовом контакте с больным сифилисом; в количе­ственном варианте постановки — для контроля эффективности лечения (в комплексе с микрореакцией); для обследования доно­ров и беременных женщин.

РИФ, РПГА и ИФА ставят обычно только в качественном ва­рианте, они высокочувствительны и становятся положительными уже в конце инкубационного периода (примерно за неделю до появления шанкра). РПГА и ИФА могут применяться также в ка­честве скрининг-тестов в случае использования неспецифическо­го антигена.

РСК с трепонемным антигеном заключается в использовании обработанного ультразвуком культурального антигена Т. pallidum. Эта реакция, согласно Приказу МЗ СССР №1161, являлась основополагающей (в комплексе с кардиолипиновым анти­геном) в лабораторной диагностике сифилиса при контроле эффективности терапии и являлась критерием излеченности (негативация серореакций), т.е. был предусмотрен количественный учет ее результата - установления титров антител. Однако для данной реакции характерны невозможность стандартизации и автоматизации постановки реакции, субъективизм оценки, зависящий от опыта и квалификации исследователя, трудоемкость, в связи с чем РСК уже много лет не входит в список стандартных методик, рекомендуемых ВОЗ и CDC для диагностики сифилиса, однако в России она до сих пор остается наиболее распространенной.