Методика постановки ифа для ликвородиагностики сифилиса

Ликвор в реакцию вводят цельным и неинактивированным. Мутный или с примесью крови ликвор центрифугируют и отсасывают надосадочную жидкость. Перед исследованием ликвор можно сохранять в морозильном отделении холодильника при температуре от -12 град.С до -18 град. С в пробирках под резиновыми пробками или в "эппендорфах" до 1 месяца. Размораживание производят при комнатной температуре. Повторное замораживание и размораживание не допускается.

При исследовании ликвора приготовление рабочих растворов, проведение ИФА и учет результатов осуществляют в соответствии с инструкцией по применению тест - систем, за исключением пунктов, касающихся разведения ликвора и приготовления рабочих растворов конъюгата. Так, исследование ликвора в отличие от исследования сыворотки или плазмы крови проводят в первой фазе реакции при его разведении 1:2 (50 мкл ликвора и 50 мкл раствора для разведения) и во второй фазе реакции с рабочим раствором конъюгата, концентрация которого увеличена в 4 раза по сравнению с указанной в инструкции для сыворотки или плазмы крови.

Количественными показателями концентрации противотрепонемных антител (степени позитивности) в ликворе являются титр противотрепонемных антител или коэффициент позитивности. Определение титров или коэффициентов позитивности целесообразно проводить как до лечения, так и после него для выяснения динамики выработки антител с использованием одной и той же тест - системы.

По своей диагностической эффективности при ликвородиагностике сифилиса ИФА близок к РИФ-ц, самой чувствительной и специфичной реакции при диагностике нейросифилиса. Положительной чертой ИФА является его доступность благодаря наличию производственных высококачественных тест - систем.

Известно, что при сифилисе, как и при других инфекционных заболева­ниях, первыми против патогенного возбудителя вырабатываются антитела класса IgM: антитрепонемный IgM появляется в крови пациентов уже через 7-14 дней после заражения и достигает максимальной концентрации на 6-9-й неделе. Через 6 мес. После окончания терапии у большинства больных в крови они не определяются. На 4-й неделе после инфицирования организм начинает продуцировать в достаточной степени специфические IgG, причем их концентрация в крови значительно превосходит таковую IgM. Этот вид иммуноглобулинов в наибольшем количестве определяется через 1-2 года после заражения. Кроме того, крупные молекулы IgM не проходят через плаценту от матери к плоду, в связи с чем по их наличию у ребенка судят об его инфицировании бледной трепонемой.

Иммунный ответ при сифилисе отличается выработкой значительного ко­личества антитрепонемных IgM антител не только на первичной стадии забо­левания, но и при рецидивах и реинфекциях, т.е. персистенцию IgM антител в организме можно рассматривать в качестве показателя наличия вирулентного возбудителя и активности инфекционного процесса.При диагностике сифилиса у ребенка, рожденного больной или лечившейся ранее матерью, роль IgM антител несомненна. Поскольку, в отличие от IgG, IgM-антитела не проникают в кровь плода через плаценту, наличие последних в сыворотке крови свидетельствует об инфицировании ребенка и позволяет диагностировать у него врожденный сифилис со всеми вытекающими пос­ледствиями (Доля О.В., 2001).

Таким образом, обнаружение антитрепонемного IgM способствует ранней диагностике сифилиса, а ввиду того, что концентрация в крови специфических IgM закономерно снижается после эффективного лечения, рост титра этих антител может служить вспомогательным признаком наличия рецидива заболевания или реинфекции.

Основным назначением теста на определение специфических IgM является определение активности сифилитического процесса, диагностику раннего врожденного сифилиса, установление излеченности, распознавание ложноположительных результатов серологических реакций, выявление рецидивов заболевания и реинфекций.

В настоящее время существуют тест-системы, позволяющие выявлять как суммарные (IgM +IgG), так и отдельные специфические антитела классов IgG и IgM.

По данным ряда авторов, чувствительность различных вариантов ИФА составляет 98-100%, специфичность - 96-100%.

К основным преимуществам ИФА, наряду с высокой эффективностью, следует отнести: автоматизацию постановки, количественный учет результа­та, возможность исследования одновременно большого количества образцов (что позволило использовать эту методику в службе переливания крови), а также простоту постановки, быстроту и легкость освоения.

Одним из современных методов диагностики сифилиса также является иммуноблоттинг (Western blot) для определения IgG либо IgM. Этот метод иногда называют линейным ИФА или линей­ным иммуноблоттингом.

Таким образом, при анализе методологий, используемых в настоящее время для серологической - основной - диагностики сифилиса, объективно проде­монстрированы неоспоримые преимущества ИФА и РПГА. С целью оптими­зации и унификации серологического обследования пациентов при подозрении на сифилис в 2001 г. МЗ РФ издало Приказ №87 от 26.03.2001 N 87 "О СОВЕРШЕНСТВОВАНИИ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ СИФИЛИСА", отменяющий Приказ №1161 МЗ СССР от 1985 г. и регламентирующий (в 2006 г.) применение нового ком­плекса при диагностике сифилиса (ИФА или РПГА в сочетании с МР).

Таким образом, алгоритм обследования и ведения пациентов при сифилисе должен быть следующим:

Первичное обследование проводят с помощью комплекса нетрепонем- ных (РМП, RPR, TRUST, VDRL или других на выбор) и трепонемных тестов: РПГА или ее модификаций (ТРРА) или ИФА (суммарный, IgG, при необходимости - IgM), РИФ.

Сомнительный результат ИФА следует подтверждать (опро­вергать) в РПГА, и наоборот.

Контрольные обследования проводят теми же методами, что и первич­ное - например, ИФА с RPR или РПГА с RPR - не ранее чем через 3 мес. после окончания полноценного курса терапии. Предпочтительно повторить исследования еще через 3-6 мес. и в срок до 1-1,5 лет после терапии. Основным при контрольном обследовании должен быть один из наиболее достоверных нетрепонемных тестов в количественном варианте. При снижении титра в 4 раза терапию считают эффективной, а после полного курса реаби­литации назначают исследование тем же трепонемным тестом, что и при первичном обследовании.

Заключительное обследование проводят не ранее, чем через 1-1,5 года после окончания полноценного курса терапии, если негативация не про­изошла ранее, оно должно быть клиническим и лабораторным - комп­лекс: двух тех же тестов - РПГА и RPR и т.д.

Ложноположительные серологические реакции на сифилис (ЛПР) — это положительные реакции у людей, которые никогда не болели и в момент обследования не болеют сифилисом. Ост­рые ЛПР нестойки, их спонтанная негативация происходит в течение 4 — 6 мес. Хронические ЛПР сохраняются более 6 мес. Частота ЛПР в среднем составляет 0,03 — 2,5 %. С возрастом коли­чество ЛПР увеличивается, у женщин они наблюдаются в 4,5 раза чаще, чем у мужчин.

Основные причины получения ЛПР следующие:

1. инфекционные заболевания, возбудители которых имеют антигенное сходство с бледной трепонемой;

2. физиологические и патологические состояния, приводящие к изменению обмена веществ, особенно липидного;

3. технические погрешности при постановке реакций.

Исследование спинномозговой жидкости.

Ликворологическая диагностика имеет большое значение для установления диагноза нейросифилиса, а также при определении излеченности боль­ного сифилисом. Показанием к исследованию спинномозговой жидкости в диагностических целях служит наличие клинических симптомов поражения нервной системы. Ликворологическое об­следование рекомендуется проводить также при вторичном си­филисе с проявлениями в виде алопеции и лейкодермы; при скрытых и поздних формах сифилиса; детям, рожденным от ма­терей, не получавших лечения по поводу сифилиса; перед сня­тием пациентов с учета после лечения и клинико-лабораторного контроля.

Для получения спинномозговой жидкости используют спин­номозговую пункцию. В норме спинномозговая жидкость прозрач­ная, бесцветная, имеет относительную плотность 1006— 1008, со­держит не более 5 клеток в 1 мм³ (лимфоциты), не более 0,33 %о белка. В норме глобулиновые реакции (Нонне—Апельта и Панди) с ликвором отрицательны или оцениваются как (+), реакция Ланге с коллоидным золотом нормального типа — 0110000000000, 0121000000000.

Со спинномозговой жидкостью ставят обычно РСК и MP (их положительные результаты служат критерием диагностики ней- росифилиса), а также РИФ или РПГА. Позитивность двух послед­них тестов при отрицательных РСК и MP и отсутствии других патологических изменений ликвора не свидетельствует о наличии специфического поражения нервной системы, а лишь отражает факт инфицированности организма бледной трепонемой. Анти- трепонемные антитела из сыворотки могут проникать в ликвор через гематоэнцефалический барьер за счет пассивного транспор­та и определяться в высокочувствительных РИФ и РПГА.

Показатели патологии ликвора при нейросифилисе — уровень белка 0,4 %о, цитоз 8 клеток в 1 мм³, реакции Панди и Нонне — Апельта (++), в реакции Ланге — более двух «2» в ряду, положи­тельные результаты РСК, MP, РИФ, РПГА.

28