Диагностика сифилиса

Несмотря на то, что лабораторная диагностика сифилиса на протяжении 100 лет со дня открытия первой серологической реакции (Wassermann А., 1906) совершенствуется, в ряде случаев постановка диагноза представляется достаточно проблематичной. Это связано как с особенностями самого возбу­дителя - Т. pallidum, так и с методами, имеющимися в распоряжении врачей- лаборантов.

Бледная трепонема, в силу морфофункциональных характеристик, чрез­вычайно критична к условиям существования и практически не растет на искусственных питательных средах.

Основные критерии диагностики. При диагностике сифилиса применяются следующие критерии:

Клиническое обследование больного;

Обнаружение бледной трепонемы в серозном отделяемом мокну­щих сифилидов кожи и слизистых оболочек путем исследования на-тивного препарата «раздавленная капля» методом темнопольной микроскопии. Обнаружение и идентификация возбудителя являет­ся надежным критерием диагноза.

Результаты серологических реакций (с сывороткой, плазмой крови, ликвором). Следует заметить, что это один из наиболее надежных критериев диагности­ки, однако в определенные периоды заболевания серологические реакции могут давать отрицательные результаты, а у некоторых пациентов — положительные при отсутствии сифилиса;

Данные конфронтации (обследования половых партнеров).

Результаты пробного лечения (therapia ex juvantibus). Этот метод диагностики используется редко, только при поздних формах си­филиса (чаще висцерального), когда другие способы подтвержде­ния диагноза невозможны.

Все методы лабораторной диагностики сифилиса можно условно подраз­делить на:

• прямые и непрямые (косвенные);

• трепонемные и нетрепонемные;

• отборочные (скрининговые) и подтверждающие (специфические и диагностические);

• приборные и методы, результаты которых оцениваются визуально.

К прямым трепонемным методам детекции Т. pallidum относят: микро­скопию в темном поле зрения («темнопольную»), реакцию заражения кроликов - микробиологический метод, а также разрабатываемые методы амплифи­кации нуклеиновых кислот - полимеразную цепную реакцию и др.

Заражение сифилисом кроликов (rabbit infectivity test - RIT) являет­ся старейшим методом прямого выявления Т. pallidum в любом клиническом материале при условии, если пациенту не была начата антибактериальная терапия. Эффективность метода объясняется высокой чувствительностью этих экспериментальных животных к заражению бледной трепонемой. Однако использование этого метода в целях клинической лабораторной диагностики сифилиса весьма ограничено из-за длительности получения результата и высокой стоимости: содержания большого, хорошо оборудованного вивария. В настоящее время метод приме­няют за рубежом в единичных исследовательских лабораториях для оценки чувствительности других методов (Лосева O.K., Ловенецкий А.Н., 2000; Grim- pel Е. и соавт., 1991; Sanchez Р. и соавт.,1993).

Наиболее убедительным доказательством трепонемной природы заболе­вания является прямая визуализация трепонем, для чего используют мик­роскопию в темном поле зрения. Положительный результат микроскопии является безусловным основанием установления диагноза «сифилис», при исключении других представителей семейства Treponemataceae: Т. refringens, Т. phagedenis, Т. denticola, Т. balanitidis, отличающимися формой, размером и характером движений и встречающимися на половых органах и в полости рта. При высокой специфичности метода чувствительность его, по данным ряда авторов, весьма различна (Young Н., 1992 и соавт.) и зависит от формы заболевания: метод наиболее эффективен при первичном и вторичном сифи­лисе, при раннем врожденном сифилисе - при наличии поражений на коже и слизистых, содержащих значительное (не менее 10⁶) количество микроорга­низмов в очаге поражения (локализации).

Исследование в темном поле микроскопа нативного препарата «раздавленная капля» — наиболее простой, надежный и инфор­мативный метод обнаружения бледной трепонемы, в связи с чем он получил широкое распространение в повседневной практике. Для исследования необходимо получить тканевую жидкость из высыпаний первичного или вторичного сифилиса, которые со­провождаются мацерацией или эрозированием (эрозивный или язвенный первичный аффект, эрозивные папулы, широкие кон­диломы и т.д.).

Поверхность эрозии или язвы необходимо осторожно, чтобы не вызвать кровотечения, очистить от загрязнений тампоном, смоченным изотоническим (0,9%) раствором хлорида натрия. Для полу­чения тканевой жидкости (серума) можно воспользоваться раз­дражением поверхности эрозии или язвы (легкое потирание бак­териологической петлей), а также методом отсоса с помощью короткой стеклянной трубочки, соединенной с резиновой гру­шей (для создания относительного вакуума). Тканевую жидкость для исследования можно получить также путем сдавливания (мас­сажа) пальцами в резиновой перчатке основания эрозии или язвы. Через некоторое время на поверхности исследуемого элемента начинает обильно выделяться бесцветная прозрачная тканевая жидкость.

Серум берется петлей и переносится на поверхность обезжи­ренного тонкого предметного стекла без царапин. При недоста­точном количестве серозный экссудат смешивается с каплей изо­тонического (0,9%) раствора хлорида натрия. Капля серума накрывается покровным стеклом и нативный препарат «раздавленная капля» исследуется с сухой системой микроскопа (объектив х40, окуляр х10 или х5) и специальным конденсором темного поля. Предва­рительно между линзой конденсора и нижней поверхностью пред­метного стекла наносится капля иммерсионного масла.

Метод микроскопии в темном поле основан на феномене Тиндаля. В специальном параболоиде-конденсоре центральная часть затенена, и лучи света от осветителя проходят только через узкую щель на периферии под очень малым углом к плоскости столика микроскопа, поэтому свет не попадает в окуляр микроскопа и поле зрения остается темным. Плотные частицы в препарате отражают свет и становятся четко видимыми на темном фоне. Все тем­ное поле зрения усеяно мельчайшими светящимися точками, на­ходящимися в беспорядочном движении (броуновское движение частиц). Более крупные и круглые очертания имеют эритроциты и лейкоциты. Бледная трепонема выглядит очень тонкой, слабосве­тящейся спиралью или пунктиром из-за более яркого освещения выпуклой части завитков.

Если после однократного ис­следования трепонема не найдена, следует назначить больному индифферентные противовоспалительные примочки из изотони­ческого (0,9%) раствора хлорида натрия и затем провести повторное ис­следование. Отрицательный результат также может быть обусловлен некачественным получением образца или исследованием ма­териала, отсутствием трепонем в данной локализации на момент взятия био­пробы, потерей возбудителем подвижности. В связи с этим отрицательный результат «темнопольной» микроскопии не имеет диагностического значения и требует дальнейшего подтверждения другими методами исследования. Кро­ме того, этот метод не обеспечивает количественной оценки содержания трепонем в организме больного, его нельзя использовать для изучения динамики патологического инфекционного процесса и эффективности терапии, а также в качестве критерия излеченности сифилиса.

Основополагающей при лабораторных исследованиях в России и во всем мире является серологическая диагностика сифилиса. С помощью серо­логических методик (в сочетании с клиническими данными) устанавливают диагноз сифилиса, изучают динамику заболевания, эффективность специфи­ческой терапии и, при необходимости (на основании серореакций), вводят те или иные коррективы в схему лечения с целью санации организма больного.

Серологические методы также подразделяют на нетрепонемные и трепонемные, отборочные и подтверждающие. Для постановки неспецифических реакций используются неспе­цифические антигены: трепонемный антиген, обработанный уль­тразвуком, получаемый из культуральных (непатогенных) штам­мов трепонем, который позволяет определять группоспецифические антитела; кардиолипиновый антиген, про­изводимый синтетическим путем, позволяющий определять антитела к липидным антигенам трепонемы — реагины.

Для постановки специфических реакций используются специфи­ческие антигены, получаемые из патогенных штаммов бледной трепонемы, культивируемых в яичках экспериментально зара­женных кроликов (позволяют определять видоспецифические ан­титела).

Любая серологическая реакция характеризуется чувствитель­ностью и специфичностью. Чувствительность реакции — способность выявлять антитела в возможно более низких концен­трациях. Специфичность — это степень соответствия поло­жительного результата реакции наличию заболевания.

Отборочные реакции используются для массовых серологиче­ских обследований на сифилис: лиц декретированных профессий, больных соматических стационаров, пациентов поликлиник и амбулаторий, а также для экспресс-диагностики в кожно-венерологических диспансерах. Они должны быть чувствительны, техни­чески просты, быстро выполнимы, экономически выгодны. При этом специфичность отборочных реакций недостаточно высока, поэтому для окончательной диагностики сифилиса они не при­меняются.

Следует упомянуть о важной особенности серологических методов диагностики - все они, независимо от эффективности используемых ингредиентов, тест-систем, приборной или визуальной оценки результата, являются косвенными, непрямыми, а с целью повышения достоверности результата и учитывая ответственность, социаль­ную значимость результата, а также опасность заболевания их проводят в комплексе.

Наиболее широкое распространение в России в качестве отборочной получила т.н. реакция «микропреципитации» (MP) с кардиолипиновым антигеном (с сывороткой), обладающая достаточными для нетрепонемных тестов чувствительностью и специфичностью, простотой в исполнении. Спе­цифичность MP составляет около 98%, чувствительность при первичном сифилисе - 81%, при вторичном - 91 %, при скрытом - 94%. Результат ее оценивается от 2+ до 4+, реакция может быть выполнена с разведением сыворотки (обыч­но от 1:2 до 1: 64).

Оборудование для взятия крови и постановки МР:

- капиллярные пипетки аппарата Панченкова;

- градуированные пипетки 1, 2, 5 и 10 мл;

- автоматические пипетки на 20-200 мкл;

- наконечники для автоматических пипеток;

- пробирки длиной 8-10 см и 14-15см, диаметром 1-1,5 см или центрифужные;

- пластинки из прозрачного материала с лунками диаметром 1-1,2 см, глубиной не менее 0,5 см;

- иглы для взятия крови из пальца и вены; шприцы;

- центрифуга, дающая не менее 1000 об/мин;

- аппарат для встряхивания;

- стерилизатор для кипячения игл, шприцов, инструментов.

Ингредиенты для МР:
	- антиген кардиолипиновый для микрореакции;
	- антиген кардиолипиновый для микрореакции;
	- натрий хлорид х.ч.;
	-натрий лимоннокислый (цитрат натрия) трехзамещенный Na3C6H5O7 5H2O;
	-мертиолат C9H9O2S Na Hg.
Растворы:
	- изотонический раствор натрия хлорида 0,9%;
	- 10% раствор холин - хлорида;
	- 5% раствор трехзамещенного цитрата натрия.

Для установления пригодности эмульсии антигена необходимы контрольные лиофилизированные сыворотки крови.

При отсутствии контрольных сывороток крови реакцию ставить нельзя.

Эмульсия кардиолипинового антигена готовится из специального кардиолипинового антигена для микрореакции преципитации. Нельзя использовать в микрореакции кардиолипиновый антиген, предназначенный для реакции связывания комплемента.

Эмульсию антигена хранят в холодильнике при 4 град. не более недели, а при добавлении раствора мертиолата - в течение 2 недель. В день постановки реакции нужное для данного рабочего дня количество эмульсии берут из холодильника, оставляют для согревания при комнатной температуре на 30 минут и перемешивают ее, затем проверяют ее пригодность на контрольных сыворотках крови. Применяемую эмульсию необходимо защищать от света, обернув пробирки с ней черной бумагой. Пригодность каждой новой серии антигена проверяют в экспресс - методе одновременно с уже бывшей в работе серией на заведомо положительных и отрицательных сыворотках крови.