24.6. Хроматография. Сущность

и классификация методов хроматографии

Открытие хроматографии принадлежит русскому бота­нику М.С. Цвету (1903).

Хроматография - это физико-химический метод раз­деления и анализа смесей газов, паров, жидкостей или растворенных веществ сорбционными методами в дина­мических условиях. Она основана на различном распреде­лении компонентов смеси между двумя фазами - неподвижной и подвижной. Вещества, составляющие непо­движную фазу, называются сорбентами. Неподвижная фаза может быть твердой и жидкой. Подвижная фаза - это поток жидкости или газа, фильтрующийся через слой сор­бента. Подвижная фаза выполняет функции растворителя и носителя анализируемой смеси веществ (сорбата), пере­веденной в газообразное или жидкое состояние. В процес­се прохождения через слой сорбента смеси веществ непре­рывно совершаются акты сорбции-десорбции.

Сорбция представляет собой сложный физико-химиче­ский процесс, который можно рассматривать как сумму более простых процессов - адсорбции и абсорбции. Изме­нение (обычно повышение) концентрации вещества на границе раздела фаз называется адсорбцией; процесс по­глощения одного вещества всем объемом другого вещества называется абсорбцией. Вещество, способное поглощать другое вещество, называется адсорбентом; вещество, ко­торое адсорбируется, называется адсорбтивом, а уже ад­сорбированное вещество - адсорбатом. Процесс, обрат­ный адсорбции, называется десорбцией.

В основу классификации многочисленных хроматографических методов положены следующие признаки.

1. По агрегатному состоянию сорбента и сорбата хрома­тографию разделяют на газовую и жидкостную. Газовая хроматография включает газожидкостную и газотвердо­фазную, жидкостная - жидкостно-твердофазную и жидкостно-гелевую. Первое слово в названии метода характе­ризует агрегатное состояние подвижной фазы, второе — неподвижной.

2. По механизму взаимодействия сорбента и сорбата вы­деляют адсорбционную или молекулярную, ионообмен­ную, распределительную, молекулярно-ситовую и аффин­ную хроматографии. Классификация по механизму весь­ма условна: ее используют тогда, когда известен домини­рующий механизм. В ряде случаев процесс разделения протекает по нескольким механизмам.

3. По технике выполнения процесса выделяют коло­ночную хроматографию, когда разделение проводится в специальных колонках, и плоскостную хроматографию, когда разделение проводится на специальной бумаге (бу­мажная хроматография) или в тонком слое сорбента (тон­кослойная хроматография).

4. По цели хроматографирования выделяют аналитиче­скую хроматографию (качественный и количественный анализ), препаративную хроматографию для получения веществ в чистом виде и промышленную (производствен­ную) хроматографию для автоматического управления процессом.

Адсорбционая (молекулярная) хроматография

Метод адсорбционной (молекулярной) хроматографии основан на различной способности к адсорбции молекул в зависимости от их строения и молекулярной массы.

В качестве адсорбентов используют порошкообразные вещества с размерами частиц 1-10 мкм: оксид алюминия, оксид кальция, силикагель, сахар, крахмал, целлюлоза, активированный уголь. Комбинируя различные раствори­тели (вода, спирты, хлороформ, бензол, циклогексан, гексан) и адсорбенты, удается подобрать удобные условия хроматографического разделения различных смесей.

Через колонку, заполненную адсорбентом, пропускают раствор компонентов разделяемой смеси. Чем слабее адсор­бируется вещество, тем больше скорость его перемещения по колонке и тем дальше оно перемещается от линии стар­та. При последующем промывании колонки чистым растворителем (процесс элюирования) первыми вымываются слабо адсорбируемые молекулы, а последними — молекулы, наиболее прочно связанные с адсорбентом. На поверхности адсорбента происходит не только адсорбция молекул из раствора, но и обратный процесс - десорбция. С течением времени устанавливается адсорбционное равновесие.

Молекулярная адсорбция различных веществ из рас­творов зависит от природы растворителя и разделяемых веществ, от природы и структуры поверхности адсорбента.

Чтобы растворенное вещество хорошо адсорбировалось на поверхности адсорбента, надо, чтобы молекулы раство­рителя плохо смачивали поверхность адсорбента и не ад­сорбировались. Например, активированный уголь хорошо адсорбирует из водных растворов органические кислоты, спирты, амины, но совсем не адсорбирует эти вещества из органических растворителей.

Вопрос о зависимости адсорбции на твердой поверхности от природы растворенного вещества очень сложен, так как одно и то же вещество по-разному адсорбируется на разных твердых поверхностях и из разных растворителей. Напри­мер, для адсорбции жирных кислот из водных растворов на угле установлено ее возрастание с повышением молекуляр­ной массы в гомологическом ряду, однако на других адсор­бентах и в других растворителях этого не наблюдается.

С измельчением адсорбента увеличивается его поверх­ность и поэтому быстрее протекает процесс адсорбции.

С повышением температуры молекулярная адсорбция всегда уменьшается, так как возрастание интенсивности молекулярно-теплового движения затрудняет фиксацию молекул на поверхности раздела фаз.

В медицине широко используется гемосорбция, при ко­торой применяются активированные угли для очистки крови от токсических веществ. В спиртовом производст­ве из водно-спиртовой смеси адсорбцией на угле удаляют сивушные масла. В сахарной и крахмалопаточной промы­шленности углем обесцвечивают сахарные и глюкозные сиропы. Во время первой мировой войны активированный уголь использовали в противогазах для защиты от боевых отравляющих веществ. Гидрофильные адсорбенты: глины и кизельгур используют при рафинировании жиров - очи­стке жиров от свободных жирных кислот, смолистых и красящих веществ.

Распределительная хроматография

Распределительная хроматография основана на разли­чии в растворимости разделяемых веществ в неподвиж­ной фазе (газожидкостная хроматография) или на разли­чии в растворимости веществ в подвижной и неподвижной жидких фазах. В последнем случае происходит перераспределение каждого вещества между двумя жидкими фазами в соответствии с его коэффициентом распределения К:

K = C₁ / C₂ , (24.17)

где С₁ - концентрация вещества в подвижной фазе; С₂ -концентрация вещества в неподвижной фазе. Наибольшее применение для разделения, анализа и исследования ве­ществ и их смесей, переходящих без разложения в парооб­разное состояние, получила газовая хроматография в обо­их ее основных вариантах: газожидкостном и газотвердо­фазном (газоадсорбционном).

В газовой хроматографии в качестве подвижной фазы (газа—носителя) используется инертный газ: гелий, азот, ар­гон, значительно реже водород и углекислый газ. В качестве адсорбентов (неподвижной фазы) применяют оксид алюми­ния, активированные угли или полимерные сорбенты.

Газохроматографический процесс обычно осуществляют в специальных приборах, называемых газовыми хромато­графами. Общая схема хроматографа приведена на рис. 24.9.

Рис. 24.9. Принципиальная схема газового хроматографа:

1 - устройство для ввода пробы в хроматографическую колонку (дозатор); 2 - хроматографическая колонка; 3 - детектор (анализирующая система); 4 - регистратор

Поток газа-носителя из баллона непрерывно подается в хроматографическую колонку, а оттуда в детектирую­щее устройство. Оно непрерывно измеряет концентрацию компонентов у выхода из колонки и преобразует ее в элек­трический сигнал, регистрируемый потенциометром. На

Рис. 24.10. Хроматограмма искусственной смеси аминокислот, входящих в состав продуктов гидролиза белков:

1 - аспарагиновая кислота; 2 - треонин; 3 - серии; 4 - глютаминовая кислота; 5 - пролин; 6 - глицин; 7 - аланин; 8 - цистин; 9 - валин; 10 - метионин; 11 - изолейцин; 12 - лейцин; 13 - тирозин; 14 - фенилаланин; 15 - гистидин; 16 - лизин; 17 - аммиак; 18 - аргинин

ленте самописца получается выходная кривая, которую называют хроматограммоа (рис. 24.10).

Полученная хроматограмма обычно представляет со­бой ряд пиков. Площадь пика пропорциональна количест­ву каждого компонента, а время выхода пика при посто­янном режиме работы прибора (постоянная температура колонки и скорость газа-носителя) характеризует приро­ду компонента. Таким образом, на одном приборе можно проводить не только разделение, но и качественный и ко­личественный анализ смесей.

Современный хроматограф может включать несколько колонок и различные детекторы, а также автоматическое устройство для подготовки и ввода пробы. Подсоединен­ный к хроматографу компьютер, имеющий запоминаю­щее устройство и банк хроматографических данных, обес­печивает аналитика богатой информацией.

Метод газохроматографического анализа очень чувст­вителен. Для его проведения часто вполне достаточно не­скольких кубических миллиметров газа, долей микролит­ра жидкости или долей микрограмма твердого вещества.

Газовая хроматография находит широкое применение в медицине для определения содержания многочисленных ле­карственных препаратов, определения уровня жирных кис­лот, холестерина, стероидов и т.д. в организме больного.

В методе тонкослойной хроматографии (ТСХ) непо­движная твердая фаза тонким слоем наносится на плас­тинку из стекла, алюминиевой фольги или полиэфирной пленки. В качестве сорбента в ТСХ применяют силикагели, оксид алюминия, крахмал, целлюлозу и другие веще­ства с высокой адсорбционной способностью. Выбор рас­творителя зависит от природы сорбента и свойств анали­зируемых соединений. Часто применяют смеси раствори­телей из двух или трех компонентов.

Пробу анализируемой жидкости в виде пятна или полосы наносят на стартовую линию (а) в 2-3 см от края плас­тинки (рис. 24.11).

Рис. 24.11. Схема определения величины

R при хроматографировании

в тонком слое

Нанесение пробы осуществляют микропипетками, ми­крошприцами или специальными приспособлениями. Край пластинки погружают в растворитель (или систему растворителей), который действует как подвижная фаза. Под действием капиллярных сил растворитель движется вдоль слоя сорбента и с разной скоростью переносит ком­поненты смеси, что приводит к их разделению.

Движение зон компонентов разделяемой смеси количе­ственно характеризуется величиной R, которая называет­ся индексом удерживания. За R принимают отношение расстояния L₁, пройденного зоной вещества от стартовой линии до центра зоны, к расстоянию L₂, пройденному растворителем за то же время (L₂ равно расстоянию от старто­вой линии до границы фронта растворителя (в) к концу опыта):

Понятно, что L_l не может быть больше L₂ и значения R лежат в пределах от нуля до единицы. Стандартное веще­ство («свидетель») в том же растворителе наносится на стартовую линию рядом с анализируемой пробой и, таким образом, хроматографируется в тех же условиях. Влияние различных факторов на все вещества будет одинаковым, поэтому совпадение R компонента пробы и одного из «сви­детелей» дает основания для отождествления веществ с учетом возможных наложений. Несовпадение R интерпре­тируется более однозначно, оно указывает на отсутствие в пробе соответствующего компонента.

По окончании хроматографирования хроматограмму высушивают и проявляют химическим или физичес­ким способом. При химическом способе пластинку оп­рыскивают раствором реактива, взаимодействующего с компонентами смеси. При обработке, например, пара­ми йода четко проявляются органические соединения. В физических способах проявления используется спо­собность некоторых веществ флуоресцировать под действием ультрафиолетового излучения. Вещества, обла­дающие радиоактивным излучением, обнаруживаются методом радиоавтографии с помощью различных фото­материалов.

Количественные определения в ТСХ могут быть сдела­ны или непосредственно на пластинке, или после удале­ния вещества с пластинки. При непосредственном опре­делении на пластинке измеряют тем или иным методом площадь пятна (например, с помощью миллиметровой кальки) и по заранее построенному градуировочному гра­фику находят количество вещества. Применяют также прямое спектрофотометрирование пластинки с помощью спектроденситометров. Наиболее точным считается ме­тод, в котором вещество после разделения удаляется с пластинки и анализируется спектрофотометрическим или иным методом.

В бумажной хроматографии в качестве носителя непо­движной жидкой фазы используется специальная хроматографическая бумага из чистой целлюлозы.

Последняя содержит гидроксильные группы, которые удерживают возле себя полярный растворитель. Чаще всего это вода, которая играет роль неподвижной жидкой фазы. Органические растворители являются подвижной фазой. К ним обычно предъявляются следующие требова­ния: растворители подвижной и неподвижной фаз не должны смешиваться, состав растворителя в процессе хроматографирования не должен изменяться, растворите­ли должны легко удаляться с бумаги.

При нанесении проб анализируемой смеси вещества, на­ходящиеся в ней, увлекаются растворителем и одновремен­но происходит распределение компонентов смеси. Более по­лярные компоненты располагаются ближе к линии старта, неполярные компоненты продвигаются дальше. Таким об­разом можно провести качественно идентификацию раз­личных соединений в присутствии стандартов («свидете­лей») или по числовому значению R каждого компонента.

По технике выполнения различают одномерную и дву­мерную бумажную хроматографию. Для получения дву­мерных хроматограмм хроматографирование производят дважды во взаимно противоположных направлениях: по­сле обработки пробы одним растворителем хроматограмму поворачивают на 90° и хроматографируют вторично уже другим растворителем. Такая методика позволяет проводить более тонкие разделения компонентов смеси.

Количественные определения, как и в ТСХ, выполня­ются по площади пятна и интенсивности его окраски. Не­редко хроматограмму разделяют на отдельные части по числу пятен. Каждое пятно обрабатывают соответствую­щим органическим растворителем или смесью раствори­телей. Вещество, перешедшее в органический слой, опре­деляют любым подходящим методом: фотометрическим, электрохимическим и др.

Ионообменная хроматография

Адсорбция электролитов из водных растворов основана на реакциях ионного обмена, протекающих между иона­ми адсорбента и ионами электролита. Эта адсорбция назы­вается ионной и составляет основу ионообменной хроматографии. В качестве адсорбентов используют ионообмен­ные сорбенты или иониты. Иониты - твердые, практичес­ки не растворимые в воде и органических растворителях вещества, содержащие в своем составе функциональные группы, ионы которых способны обмениваться на ионы, находящиеся в растворе. Избирательность ионообменной адсорбции существенным образом зависит от природы ад­сорбента, т.е. от того, какие функциональные группы вхо­дят в состав ионита. Иониты, обменивающие свои катио­ны на катионы электролита, содержащиеся в растворе, называются катионитами; иониты, способные обмени­вать свои анионы на анионы электролитов, называются анионитами. Процессы ионного обмена на катионитах и анионитах можно выразить соответственно схемами:

Катионный обмен

RАn^- Н⁺ + Na⁺ + Сl^- ↔ RАn^- Na⁺ + Н⁺ + Сl^-;

Анионный обмен

RKt⁺ OH^- + Na⁺ + Cl^- ↔ RKt⁺Cl^- + Na⁺ + OH^-.

Здесь R - полимерный радикал, образующий вместе с ионообменной группой каркас ионита; Аn^- и Kt⁺ — ионооб­менная группа или фиксированный ион, обусловливаю­щий заряд каркаса. Ионный обмен сопровождается изме­нением реакции среды. В случае катионного обмена среда становится кислой; в случае анионного обмена - щелоч­ной. В катионитах функциональными ионообменными группами являются: - SO₃H; - РО₃Н₂; - СООН; - SH; - ОН; аниониты имеют в своем составе функциональные ионооб­менные группы - NH₂, =NH, ≡ N, - N(CH₃)₃ и др.

Иониты применяются в качественном анализе для раз­деления катионов и анионов и для концентрирования раз­бавленных растворов. Широкое применение нашли иони­ты в биологии и медицине, пищевой и фармацевтической промышленности, в других отраслях народного хозяйства.

Молекулярно-ситовая хроматография

В основе этого варианта хроматографии лежит прин­цип разделения смеси веществ по их молекулярным разме­рам или молекулярным массам. Его называют также гель-фильтрацией или гель-хроматографией. Метод широко ис­пользуют для выделения и очистки биополимеров - белков, пептидов, поли- и олигосахаридов, нуклеиновых кис­лот и даже клеток, например, тромбоцитов.

В качестве носителей в молекулярно-ситовой хромато­графии используются различные гели с трехмерной сетча­той структурой - декстрановые (сефадекс), полиакриламидные (биогель Р), агарозные (сефароза) или на основе стирола и дивинилбензола, простые силикагели, а также пористые стеклянные гранулы. Все гели и стекла имеют поры строго определенных размеров, по возможности, не содержат ионогенных групп и не обладают химическим или биологическим сродством к анализируемым вещест­вам. Гелями называют дисперсные системы с жидкой или газообразной дисперсионной средой, в которой частицы твердой дисперсной фазы связаны между собой молеку­лярными силами сцепления различной природы.

Молекулярно-ситовая хроматография может быть вы­полнена в колоночном и тонкослойном вариантах. Пре­имущество отдают колоночному варианту.

Если набухшие гранулы декстранового геля (сефадекса) поместить вместе с растворителем в вертикальную ко­лонку и внести на поверхность смесь веществ, то разделе­ние смеси веществ происходит за счет того, что в поры ге­ля могут проникать только вещества, размеры молекул которых не превышают размеров пор. В результате диф­фузий (проникновения) внутрь пор геля молекулы мень­шего размера элюируются с геля позже, чем более круп­ные молекулы, не проникающие в поры геля (рис.24.12).

Рис. 24.12. Схема опыта по молекулярно-ситовой

хроматографии.

(Показано более быстрое продвижение крупных молекул

белка.)

• - большие молекулы; О - поры геля; • - малые молекулы

Декстрановые и полиакриламидные гели широко исполь­зуются для освобождения органических веществ, от ионов неорганических солей. Для обессоливания белков подбира­ют мелкопористые сефадексы. Высокомолекулярные веще­ства (ВМВ) (белки, полисахариды) не проникают в поры этих сефадексов, а неорганические соли, наоборот, проникают. При добавлении растворителя в колонку ВМВ выходят из нее первыми, а соли выходят из колонки значительно позже.

Молекулярно-ситовая хроматография применяется и для определения молекулярных масс белков.

Аффинная (биоспецифическая) хроматография

Аффинная хроматография - это метод очистки и разде­ления белков, основанный на их избирательном взаимо­действии с лигандом, ковалентно связанным с инертным носителем (иммобилизованный лиганд). В качестве лигандов используют соединения, взаимодействия которых с разделяемыми веществами основано на биологической функции последних. Так, при разделении ферментов лигандами служат их субстраты, ингибиторы или коферменты. Главная особенность, которая обусловливает высокую эффективность аффинной хроматографии, состоит в том, что разделение основано на различии не физико-химиче­ских признаков молекулы (заряда, формы и размера), а специфических функциональных свойств, отличающих данный фермент от множества других биополимеров.

Схематически (рис. 24.13) процесс разделения веществ с помощью аффинной хроматографии можно представить следующим образом. Колонку заполняют носителем, прочно связанным с каким-нибудь биологически актив­ным веществом (лигандом). Пропускают через колонку анализируемую смесь веществ, к одному из которых ли­ганд обладает биологическим сродством. Лиганд из всей смеси веществ выбирает «свое» вещество и образует с ним биоспецифический комплекс. В результате этого вещество останется в колонке связанным с лигандом, а все осталь­ные компоненты смеси пройдут через колонку, не задер­живаясь. После этого можно изменить буферный раствор, подобрав условия, при которых комплекс лиганда с избранным им веществом распадается и чистое вещество вы­мывается этим буферным раствором из колонки.

Рис. 24.13. Механизм аффинной хроматографии:

_

Л - лиганд; Л — иммобилизованный лиганд; М — биологически

_

активное вещество; МЛ - биоспецифический комплекс; ∆ - примеси; О - несорбирующиеся компоненты смеси

В настоящее время метод аффинной хроматографии применяется для выделения и очистки многих природных белковых молекул (антител, антигенов, ингибиторов, фер­ментов, гормонов, клеточных рецепторов), специфических пептидов, гликопротеидов и гликолипидов, полисахари­дов, моносахаридов, нуклеиновых кислот и нуклеотидрв, липидов, субклеточных частиц и многих видов клеток.

ВОПРОСЫ

1. Что такое хроматография?

2.Какие признаки положены в основу классификации хроматографических методов?

3. Что положено в основу адсорбционной хроматографии?

4. Какие адсорбенты, и растворители применяются в ад­сорбционной хроматографии?

5. От каких факторов зависит молекулярная адсорбция из растворов?

6. Где используется молекулярная адсорбция?

7. Что такое коэффициент распределения?

8. Какие варианты газовой хроматографии вы знаете? Что используется в газовой хроматографии в качестве по­движной фазы?

9. Из каких основных частей состоит газовый хромато­граф?

10. Что такое хроматограмма?

11. Как проводится анализ веществ методом тонкослойной хроматографии?

12. Как обнаруживаются разделяемые вещества в тонком слое сорбента и каким образом затем количественно оп­ределяются?

13. Что используется в качестве носителя неподвижной жидкой фазы в бумажной хроматографии?

14. Какие виды бумажной хроматографии различают в зави­симости от техники выполнения?

15. Что такое иониты? Напишите реакции ионного обмена на ионитах.

16. В каких отраслях народного хозяйства применяются ио­ниты?

17. С какой целью используется молекулярно-ситовая хроматография?

18. Что применяется в качестве носителей в молекулярно-ситовой хроматографии?

19. Какова главная особенность аффинной хроматографии в отличие от других хроматографических методов?

20. Для выделения и очистки каких веществ используется метод аффинной хроматографии?

ОТВЕТЫ НА ВОПРОСЫ ТЕСТОВОГО САМОКОНТРОЛЯ

	Тема	Ответы
1 2	Кислотно-основное титрование Оксидиметрия	1 бг; 2абв; 3абв; 4бг; 5абв; 6ав; 7г; 8абв; 9бг; 10ав 1г; 2а; 3в; 4г; 5б; 6б; 7д; 8в; 9а; 10д; 11г; 12в; 13а; 14д; 156; 16а; 17д; 18в; 19г; 20б

281