Индикаторная реакция

Аминотрансферазная реакция

Образование кетокислоты

Основная реакция

Рис. Сочетание основной и ндикаторной реакции при определении ак­тивности АсАТ и АлАТ методом непрерывной регистрации

При определении активности аминотрансфераз кинетическим ме­тодом требуется фотометр, позволяющий проводить измерения при длине волны 340 нм. Температуру инкубационной среды в кювете не­обходимо поддерживать на постоянном уровне. Запуск реакции про­водят после окончания восстановления при участии НАДН₂ эндоген­ных кетокислот, попадающих в инкубационную среду вместе с иссле­дуемым образцом. После окончания лаг-фазы реакцию запускают добавлением субстрата — а-кетоглютаровой кислоты и контролируют изменение поглощения АА/мин. В связи с тем, что величина погло­щения инкубационной среды в начале реакции колеблется в пределах 1.3—1.5, для установки исходного поглощения реакционной смеси в пределах 0.7-0.9 в качестве контрольной пробы (blank) используют раствор бихромата калия.

Для определения активности АсАТ было предложено сочетание иных ферментативных реакций, в частности, использование в качестве индикаторного фермента глютаматдегидрогеназы (ГлДГ) и НАД каче­стве кофермента (рис.). Для расчета активности АсАТ использует­ся скорость образования НАДН₂, т. е. увеличение экстинкции, а не уменьшение, как в предыдущей реакции.

В настоящее время активность АсАТ и АлАТ в сыворотке в подав­ляющем большинстве зарубежных лабораторий определяют кинетичес­кими методами. Наиболее популярные в настоящее время методы оп­ределения АлАТ приведены в таблице 20. Методы различаются по не­которым параметрам: концентрации субстрата, типу буферного

Аспарагиновая кислота

НАДН₂

а-КГ

ЩУК

НАД

Глютамат

Рис.. Сочетание реакций при определении активности АсАТ при исполь­зовании ГлДГ в качестве индикаторного фермента

Сравнительная характеристика методов определения активности АлАТ
Компоненты инкубационной среды	ААСС"	IFCC11	Scandina­vian"	DGKC"
Конечная концентрация реактивов (ммоль/л)
L-апанин	500	500	400	800
а-кетоглютаровая кислота	15	15	12	18
рН буферного раствора	7.3	7.5	7.4	7.4
ТРИС	76	100	20	-
Фосфатный	-	-	-	80
НАДН2	0.16	0.18	0.15	0.18
П-5'-Ф	0.1	0.1	-	-
ЛДГ(Е/л)	1.2	1.2	2.0	1.2
ЭДТУК	-	-	0.5	-
Соотношение сыворотка/среда	0.082	0.083	0.12	0.135
Температура	30 °С	30 °С	37 °С	37 °С

¹⁾ААСС — Американская ассоциация клинической химии, ²⁾IFCC — Международ­ная федерация клинической химии, ³⁾SSCC — Скандинавское общество клиничес­кой химии и клинической физиологии, ⁴⁾ DGKC — Немецкое общество клиничес­кой химии

раствора (ТРИС или фосфатный ) и температуре реакции. При выбо­ре условий реакции авторы стремились подобрать оптимальные соот­ношения между компонентами инкубационной среды, определяющи­ми скорость реакции. Определение аминотрансферазной активности образца рекомендуют проводить в присутствии кофермента аминот­рансфераз П-5'-Ф. Несмотря на различия, используемая концентрация субстрата обеспечивает скорость реакции в пределах 96 % от теорети­ческих значений V_max.