3.Кинетика ферментативного катализа (продолжение).

3.3.Ингибиторы и активаторы ферментов.

Соединения, которые при добавлении их в реакционную смесь вызывают уменьшение скорости ферментативной реакции, называются ингибиторами. Один из классов ингибиторов – необратимые ингибиторы или каталитические яды. Они взаимодействуют с ферментом и снижают его активность до нуля, например, ионы тяжелых металлов.

Другим классом ингибиторов является обратимые ингибиторы. Они образуют с ферментом динамические комплексы. Эти комплексы отличаются по своим каталитическим свойствам от свободного фермента. Фермент в присутствии ингибитора может характеризоваться более высоким численным значением константы Михаэлиса K_m. Такой вид ингибирования получил название конкурентное ингибирование. При реакции может наблюдаться также более низкое значение максимальной скорости υ_max – это чистое неконкурентное ингибирование. При ферментативной реакции могут наблюдаться численные значения υ_max и K_m, уменьшенные в одинаковой степени – это бесконкурентное ингибирование, или определенная комбинация υ_max и K_m – это смешанное ингибирование. Понятие «чистое неконкурентное ингибирование» используется редко.

Для определения типа ингибирования используют механизм, предложенный Боттсом и Моралесом. Большинство простых типов ингибирования являются частными случаями этого механизма, представленного на схеме (Е – фермент; I – ингибитор; S – субстрат; Р – продукт реакции):

Эта схема включает четыре формы фермента (E, ES, EI и EIS) и шесть реакций, протекающих между ними. Все простые случаи можно получить, если не учитывать некоторых реакций. Например, ингибирование является конкурентным, если отсутствует форма EIS и протекающие с ее участием реакции; неконкурентным, если отсутствует форма EI, и смешанным, если в схеме присутствуют обе указанные выше формы (EIS и EI), однако прямой переход между ними невозможен. Схема Боттса – Моралеса особенно полезна при анализе ингибиторов, которые не являются продуктами ферментативной реакции.

Эта схема описывает также некоторые механизмы действия активатора, когда в систему вносят вещество, повышающее скорость реакции. Поэтому ее можно рассматривать как общую схему, описывающую механизм действия модификаторов, под которыми понимают как ингибиторы и активаторы одновременно.

3.3.1.Конкурентное ингибирование.

Самый распространенный тип ингибирования назван конкурентным ингибированием, поскольку наиболее простое объяснение данного типа ингибирования сводится к тому, что ингибитор связывается с тем же самым активным центром молекулы фермента, что и субстрат. При этом образуется непродуктивный комплекс. Субстрат и ингибитор конкурируют за один и тот же центр связывания и, следовательно, может образоваться только один комплекс фермента с ингибитором – EI. В простейшем случае конкурентного ингибирования EI представляет собой «тупиковый» комплекс, поскольку он распадается в результате диссоциации только на исходные компоненты (E + I). Поэтому концентрация комплекса EI определяется истинной константой равновесия:

К_i = [E] ∙ [I]/[EI].

Данную константу (К_i) называют константой ингибирования. Полное уравнение стационарной скорости для случая простого конкурентного ингибирования имеет следующий вид:

υ_max ∙ [S]

υ_о = —————————,

K_m ∙ (1 + [I]/К_i) + [S]

где: [I] – концентрация свободного ингибитора.

Это уравнение совпадает по форме с уравнением Михаэлиса – Ментен, то есть его можно записать в следующем виде:

υ_о = υ_{max, каж} ∙ [S]/(K_{m, каж} + [S]),

где: υ_{max, каж} и K_{m, каж} – «кажущиеся» значения параметров υ_max и K_m, которые определяются следующими выражениями:

υ_{max, каж} = υ_max; K_{m, каж} = K_m ∙ (1 + [I]/К_i).

υ_max/K_m

При этом: υ_{max, каж}/K_{m, каж} = ——————.

(1 + [I]/К_i)

Следовательно, влияние конкурентного ингибитора на скорость ферментативной реакции состоит в том, что он увеличивает кажущееся значение константы Михаэлиса K_m в (1 + [I]/К_i) раз и уменьшает в то же число раз кажущееся значение υ_max/K_m, оставляя без изменения величину υ_max.