10. Типы рнк в клетке, особенности их стороения.

Молекула РНК включает 4-6 тысяч отдельных нуклеотидов и молекулярная масса их равна 1,5-2 млн. молекула РНК состоит из одной длинной неразветвленной цепи. Известны три типа РНК: информаци­онная (и-РНК), называе­мая иногда матричной РНК или РНК-посредни­ком, транспортная (т-РНК) и рибосомная (р-РНК). Молекула инфор­мационной РНК состоит из сотен нуклеотидов, дли­на ее составляет от тысячи до нескольких тысяч анг­стрем; и-РНК передает наследственную информа­цию из ядра в цитоплаз­му; транспортная РНК представлена двадцатью различными формами — по числу аминокислот, входящих в состав моле­кул белков. Длина ее мо­лекулы около 0,026 мкм, состоит она примерно из 70 нуклеотидов. С по мощью т-РНК аминокислоты доставляются к месту синтеза бел­ка — рибосомам.Рибосомная РНК, как указывает само ее название, входит в состав рибосом клетки. Она имеет молекулярную массу 1,5—2 млн. и состоит из 4—6 тыс. нуклеотидов.В результате взаимодействия трех указанных типов РНК в клетке происходит синтез специфических ферментов и всех бел­ков. РНК всех живых организмов не способна к делению и удвое­нию, ее молекулы образуются по моделям соответствующих молекул ДНК. Но у многих видов вирусов РНК способно к авторепродукции.

11. Транскрипция, обратная транскрипция. Синтез белка в клетке. Транскрипция ДНК. Это — перенос генетической информации, закодированной в последовательности пар нуклеотидов, с двуце-почечной молекулы ДНК на одноцепочечную молекулу РНК. При этом матрицей для синтеза РНК служит только одна цепь ДНК, называемая смысловой.В транскрипции, как и в других матричных процессах, различа­ют три стадии: инициацию, элонгацию и терминацию. Фермент, осу­ществляющий этот процесс, называют ДНК-зависимой РНК-по­лимеразой или просто РНК-полимеразой; при этом полимериза­ция прлирибонуклеотида (РНК) происходит в направлении от 5'- к З'-концу растущей цепи. В результате транскрипции наследственная информация, запи­санная в ДНК гена, точно транскрибируется (переписывается) в нуклеотидную последовательность мРНК. Синтез мРНК начина­ется с участка инициации транскрипции, называемого промото­ром. Промотор расположен перед геном и включает в себя около 80 пар нуклеотидов (у вирусов и бактерий этот участок соответ­ствует примерно одному витку спирали ДНК и включает около 10 пар нуклеотидов). В нуклеотидных последовательностях про­моторов часто встречаются пары AT, поэтому их называют также ТАТА-последовательностями. Транскрипция осуществляется с помощью ферментов РНК-по-лимераз. У эукариот известны три типа РНК-полимераз: I — от­ветственен за синтез рРНК, II — за синтез мРНК; III — за синтез тРНК и низкомолекулярной рРНК — 5S РНК. РНК-полимераза прочно связывается с промотором и разъеди­няет нуклеотиды комплементарных цепей. Затем этот фермент Начинает двигаться вдоль гена (молекулы ДНК) и по мере разъе­динения цепей ведет на одной из них (смысловой) синтез мРНК, Присоединяя согласно принципу комплементарности аденин к Тимину, урадил к аденину, гуанин к цитозину и цитозин к гуани гуани­ну. Те участки ДНК, на которых полимераза образовала мРНК, Вновь соединяются, а синтезируемая молекула мРНК постепенно отделяется от ДНК. Окончание синтеза мРНК определя ется участком остановки транскрипции — терминатором. Нуклео тидные последовательности промотора и терминатора узнаются специальными белками, регулирующими активность РНК-поли-меразы. Перед выходом из ядра к начальной части мРНК (5'-концу) присоединяется остаток метилированного гуанина, называемый «колпачком», а к концу мРНК (З'-концу) — около 200 остатков адениловой кислоты. В таком виде зрелая мРНК проходит через ядерную мембрану в цитоплазму к рибосоме и соединяется с ней. Полагают, что у эукариот «колпачок» мРНК участвует в связыва­нии ее с малой субъединицей рибосомы. Обратная транскрипция. Данный вид специализированного пе­реноса генетической информации не от ДНК к РНК, а наоборот от РНК к ДНК, обнаружен в клетках животных, инфицированных вирусами определенного типа. Это особый тип РНК-содержащих вирусов, называемых ретровирусами. В настоящее время установ­лено, что еще один тип вирусов — ДНК-содержащий вирус гепа­тита В в своем развитии также использует перенос информации от РНК к ДНК. После проникновения РНК ретровируса в клетку хозяина ви­русный геном подвергается обратной транскрипции. При этом сна­чала образуется дуплекс РНК — ДНК, а затем двухцепочечная ДНК. Эти этапы предшествуют экспрессии вирусных генов на уровне белков и образованию РНК-геномов.Фермент, катализирующий комплементарное копирование РНК с образованием ДНК, называется обратной транскриптазой. Он содержится в ретровирусных частицах (вирионах) и активизирует­ся после попадания вируса в клетку и разрушения его липидно-гликопротеиновой оболочки.Появляется все больше данных о том, что обратная транскрип­ция происходит и в самых разных эукариотических клетках, а об­ратная транскриптаза играет важную роль в процессах перестрой­ки генома.Обратные транскриптазы ретровирусов — это по существу ДНК-полимеразы, которые могут использовать in vitro в качестве матри­цы ДНК. Ретровирусы оказались очень полезным инструментом совре­менных генно-инженерных исследований. Они служат источни­ком для получения практически чистой обратной транскриптазы — фермента, играющего важнейшую роль в многочисленных рабо тах, основанных на клонировании эукариотических генов. Так, очищенную индивидуальную мРНК, кодирующую интересующий исследователя белок, как правило, выделить гораздо легче, чем фрагмент ДНК генома, кодирующий этот белок. Затем с помощью обратной транскриптазы можно получить ДНК-копию этой мРНК и встроить ее в подходящую плазмиду для клонирования и выра­ботки значительных количеств нужной ДНК.

12 Регуляция белкового синтеза. Схема ген. Контроля синтезов ферментов у бактерий. Строение оперона. Чтобы в клетке начался синтез определенного фермента, в нее из окружаю­щей среды должно проникнуть какое-то вещество, способное инду­цировать этот процесс. Такое вещество называется индуктором. Очень часто им бывает естественный субстрат фермента. Напри­мер, если в среду с микробными клетками, растущими на глюко­зе, добавить другой вид сахара — лактозу, то он начнет ими сбра­живаться так же, как и первый. В этом случае лактоза оказалась тем специфическим субстратом-индуктором, который индуцировал образование в микробных клетках нового фермента. синтез фермента может не только приспособительно инду­цироваться, но и подавляться, репрессироваться. Подавление син­теза фермента происходит тогда, когда концентрация какого-либо вырабатываемого клеткой вещества превысит определенный уро­вень. Часто таким репрессором служит какая-либо аминокислота высокой концентрации, токсичная для клетки. синтез ферментов в клетке регулируется меха­низмами индукции и репрессии. Все гены находятся в большой самовоспроизводящейся моле­куле ДНК- Каждый из них представляет собой небольшой участок такой молекулы. Но по своим функциям гены неодинаковы. Одни из них несут информацию о последовательности аминокислот в белковой молекуле, т. е. определяют ее структуру, другие регули­руют активность первых и контролируют тем самым процесс по­ступления информации от ДНК к ы-РНК. Первая группа генов получила название структурных, вторая — регуляторных. Струк­турные гены, контролирующие синтез ферментов в какой-то од­ной цепи реакций, расположены обычно рядом друг с другом. Они составляют единый блок, называемый опероном, и осуществляют последовательные этапы синтеза одного фермента, работая согла­сованно, как один элемент. Согласно модели строения хромосом, предложенной Ф. Криком, структурная (информативная) зона опе­рона, несущая информацию для синтеза белков, расположена в междисковой части хромосомы, регуляторная же (акцепторная) его часть, входит в состав дисков. Гены в опероне или все активны, или все бездействуют. Гены одного оперона осуществляют все следующие одна за другой ре­акции синтеза конечного продукта. Поэтому синтезируются или все ферменты в цепи реакции, или не синтезируется ни один из них. Вся группа генов одного оперона включается в процесс син­теза и выключается из него одновременно. Включение и выключе­ние структурных генов составляет сущность всего процесса регу­ляции. Функции включения и выключения выполняет особый уча­сток молекулы ДНК — ген-оператор, расположенный в самом на­чале оперона. Ген-оператор до тех пор, пока к нему не присоеди­нится молекула репрессора, находится во включенном состоянии. Как только репрессор связывается с геном-оператором, весь опе-рон выключается, и его гены становятся неактивными. Если ре­прессора нет, структурные гены включаются, и идет синтез моле­кул РНК, переносящих в цитоплазму информацию для синтеза всего набора ферментов, вырабатываемых данным опероном. Репрессор представляет собой вещество белковой природы. Он синтезируется геном, расположенным на каком-то расстоянии от оперона. Этот ген называется геном-регулятором. Ген-регулятор непрерывно посылает в цитоплазму ы-РНК, содержащую инфор­мацию для синтеза белков-репрессоров. Таким образом, функция гена-регулятора заключается в управлении синтезом молекул ре­прессора, которые затем соединяются с оператором и воздейству­ют на механизм включения структурных генов оперона. Работа гена-регулятора, вырабатывающего молекулы репрессора, направ­ляется и контролируется цитоплазмой клетки и зависит от внеш­них условий. механизм регуляции белкового синтеза представляет собой совер­шенную самонастраивающуюся и самоуправляющуюся биокибер­нетическую систему, основанную на принципе действия обратной связи. Поступление управляющей информации от ДНК на синтез определенного фермента регулируется потоком обратной информа­ции о произведенном количестве этого фермента и потребности в нем клетки в каждый данный период.

13 Строение генов эукриот. Посттранскрипционные преоброзования и РНК у эукариот. Ген — участок большой самовоспроизводящейся молекулы ДНК, контролирующий последовательность аминокислот в одной полипептидной цепи белковой молекулы (рис. 64). Ген кодирует полипептид или изофермент — определенную фракцию фермента. Он является дискретной единицей наследственной информации, это локус (участок) хромосомы, оказывающий специфическое влияние на развитие организма.Ген — сложная, делимая, молекулярно-биологическая структу­ра. Он состоит из единиц низшего порядка — нуклеотидов. Их чис­ло и взаиморасположение определяют специфичность каждого от­дельного гена. Любой ген имеет определенную величину, выра­женную числом нуклеотидов и молекулярной массой.Величина гена связана с размером того белка, который образу­ется под его контролем. Ген занимает примерно одну десятитысячную часть хромосомы. Как элемент наследственности ген входит в не­прерывную линейную структуру хромосом. Каждый ген действует в системе целостного генотипа на ряд признаков, и каждый при­знак определяется действием многих генов. Гены определяют по­следовательную цепь процессов морфологической и биохимической дифференциации организмов и непрерывно действуют на протя­жении всей его жизни. Транскрипция генетической информации. Она осущест­вляется путем синтеза информационной РНК (и-РНК) на ДНК-матрице. Название информационной эта РНК получила за то, что она, проникая через поры ядерной оболочки, несет в цитоплазму (к месту синтеза белка) информацию о порядке чередования нук­леотидов в молекуле ДНК. Строится молекула «-РНК на одной из цепочек молекулы ДНК-матрицы во время ее раздвоения при уча­стии специального фермента РНК-полимеразы Спаривание нуклеотидов идет по принципу комплементарно-сти: последовательность нуклеотидов в молекуле ы-РНК опреде­ляется их последовательностью в цепочке ДНК, при этом гуани-ловая кислота соединяется с цитидиловой, тимидиловая — с аде-ниловой, а адениловая кислота ДНК не с тимидиловой, как это бывает при репликации ДНК, а с уридиловой кислотой. Одна мо­лекула и-РНК, как правило, несет информацию о строении одной ■полипептидной цепи.Как только заканчивается построение на ДНК-матрице цепи •и-РНК, она сразу же переходит в цитоплазму и прикрепляется там к одной из рибосом. Вслед за этим начинается синтез белка.

14. Проблемы генной инженерии. Методы выделения и синтез генов. Понятия о генных векторах. Генная инженерия — раздел молекулярной биологии, связанный с конструированием in vitro новых комбинаций генетического ма­териала, способного размножаться в клетке и синтезировать опре­деленный продукт. Эта технология представляет большой практи­ческий интерес для медицины, сельского хозяйства, промышлен­ности, поскольку отныне можно получать в необходимых количе­ствах ранее дефицитные активные вещества и фармацевтические препараты. Генная инженерия решает такие важные задачи, как: получение генов, путем выделения их из клеток или синтеза; получение рекомбинантных молекул ДНК; клонирование генов; введение генов в клетку и синтез чужеродного ей белка. Главную роль на первом этапе выделения гена отводят эндонук-~азам рестрикции, или рестриктазам. Эти ферменты разрезают ДНК вблизи или внутри определенных последовательностей нукле-твдов, которые одинаковы на обеих комплементарных цепях. Два зрыва в одинаковых позициях комплементарных цепей на концах рагмента образуют так называемые липкие концы, которые могут Вновь замыкаться благодаря комплементарное™ оснований. Отыскание нужного гена среди смеси рестрикционных фраг­ментов представляет известные сложности. Наряду с этим наибо­лее распространенным способом получения генов существует так­же способ химического синтеза генов. Г. Корана* с сотрудниками синтези­ровали химическим путем кодирующую часть гена для этой РНК размером 77 п. н. В 1976 г. Сейчас созданы специальные автоматы для синтеза ДНК заданной последовательности. Те же подходы используют для синтеза так называемых ДНК-зондов — небольших фрагментов ге­нов размером 20—30 п. н. Химический и энзиматический синтез генов имеет определен­ные преимущества перед их поиском среди рестрикционных фраг­ментов. Однако эти методы имеют и недостатки, поскольку синте­тические гены чаще всего лишены ряда регуляторных элементов, необходимых для их полноценной экспрессии. Для улучшения сортов нужный ген вводят в растительную етку с помощью специальных векторов (рекомбинантных плаз-"д Agrobacterium tumefaciens или A. rhizogenes). Затем из транс- рмированной клетки методом культуры тканей регенерируют олноценное растение с новыми биологическими свойствами, эщее семена нового сорта. группа ученых успешно пересадила ген одного из ферментов фотосинтеза (точнее, малой субъединицы этого фер­мента), который экспрессируется у полученного потомства. Использование в качестве вектора рекомбинантной плазми-ды бактерии Agrobacterium rhizogenes имеет некоторую специфику. Она обладает плазмидой Ri, в которой также содержится Т-ДНК, способная встраиваться в хромосомную ДНК растительных кле­ток. В данном случае Т-ДНК вызывает обильное корнеобразова-ние — синдром hairy-root. Эта Т-ДНК функциональна, поскольку трансформированные клетки корней синтезируют опины. Пре­имущества данного вектора (в сравнении с плазмидой Ti) состоят в том, что регенерация из корней представляется намного более простой и быстрой, чем из клеток раковой опухоли. Использование методов генной инженерии позволяет решать самые разнообразные селекционные задачи. Особенно большие успехи достигнуты при переносе в растения генов устойчивости к болезням, вредителям, гербицидам и др. не следует забывать,селекция новых сортов затрагивает свойства, контролируемые ень многими генами одновременно, и невозможно все их под-ргнуть генно-инженерным манипуляциям.

15 Способы получения рекомбинантной ДНК. Прямые методы переноса генов. Рекомбинантная ДНК— это искусственно полученная ДНК, Которая включает ген (гены), являющийся объектом генетических манипуляций, и вектор, обеспечивающий размножение рекомби­нантной ДНК и синтез в клетке хозяина определенного продукта, Кодируемого внесенным геном. Векторы должны обладать следующими особенностями: 1) иметь свойства репликона; 2) нести субстратные участки для рестриктаз, без чего невозможна встройка ДНК; 3) содержать один или не­сколько генов-маркеров, позволяющих по фенотипу констатиро­вать факт его передачи. Конструирование рекомбинантных молекул ДНК началось с получения гибридных ДНК между плазмидами. В 1974 г. Дж. Морроу ис­пользовал в качестве вектора ДНК плазмиды pSC101 E. coli и в качестве переносимого ген-специфичного материала — фрагмент ДНК из хромосомы африканской шпорцевой лягушки (Xenopus laevis), кодирующий синтез молекул рибосомной ДНК. Фрагменты ДНК, детерминирующие синтез молекул рРНК , «пришивались» к плазмиде. Затем гибридны­ми молекулами трансформировали Е. coli по признаку устойчиво­сти к тетрациклину. Все тесты показали наличие генетического материала в плазмидах, способных к репликации в клетках бактерии.

16. Народнохозяйственные задачи, решаемые генной инженерией. Полагают, что генная инженерия особенно перспективна при изучении процессов развития и дифференциации растений, что поможет в будущем правильнее организовать селекционный про­цесс. Молекулярная биология предложила несколько интересных вспомогательных методов. Так, Р. Оуэне и Т. Динер (1981) в США спользовали фрагменты ДНК (зонды) для выявления вируса ране опасной болезни картофеля — веретеновидности клубней, оказав тем самым простой метод диагностики. Исследователям из Института растениеводства в Кембридже (Великобритания) алось таким способом идентифицировать в геноме пшеницы фрагменты хромосом ржи после скрещивания этих видов между бой. Примеры использования генной инженерии не ограничивают-приведенными. Одним из перспективных направлений ее при-енения считают придание растениям устойчивости к поздним весенним и ранним осенним заморозкам, которые причиняют сель-ому хозяйству огромный ущерб. Однако не следует забывать, селекция новых сортов затрагивает свойства, контролируемые очень многими генами одновременно, и невозможно все их под-"ргнуть генно-инженерным манипуляциям. Заманчивой представляется проблема биологической фиксации азота — создание культурных злаков, содержащих гены фермента нитрогеназы, необходимого для ассимиляции атмосферного азота. Такие гены известны у некоторых видов бактерий, которым не тре­буются для роста соли аммиака или азотной кислоты. В самое последнее время показана возможность переноса генов бактерий в клетки растений. Включение в геном растительных клеток бактериальных генов и синтетических матриц для придания им новых свойств, имело бы огромное значение. Генная инженерия может в дальней­шем беспредельно изменять возможности отдаленной гибридиза-. ции растений.

17. Особенности и принципиальное значение метода гибридологического анализа, разработанного Менделем. Основные закономерности наследования впервые были разра­ботаны Грегором Менделем. В отличие от своих предшественни­ков, изучавших наследственность как единое целое, в совокупности проявления всех отличимых признаков и свойств, Мендель иссле­довал это сложное явление аналитическим путем.Любой организм обладает многими наследственными признака­ми. Наследование каждого из них Г. Мендель предложил изучать независимо от того, как наследуются другие. В качестве основного объекта для своих опытов, проводившихся с 1856 по 1863 г., он выбрал горох. У этого растения — строгого самоопылителя — име­ется много форм с хорошо отличимыми (альтернативными) при­знаками. Метод, с помощью которого Мендель изучал наследственность у гороха, заключается в следующем.Сорта гороха, выбранные для скрещивания, различались между собой хорошо заметными признаками. При размножении эти признаки стойко наследовались. Контрольная проверка чисто­ты избранных для скрещивания сортов проводилась в течение двух лет.Скрещивались сорта, отличающиеся по одной или небольшо­му числу пар контрастных (аллеломорфных) признаков, например желтая и зеленая окраска семян, гладкая и морщинистая форма их, красная и белая окраска цветков, низкий и высокий рост и др. В опытах Г. Менделя с горохом изучалось наследование по семи парам признаков.Проводился точный количественный учет растений по каж­дой паре изучаемых признаков. В каждом скрещивании произво­дился анализ потомства в последовательном ряду поколений.Методика, примененная Г. Менделем при изучении явлений на­следственности у гороха, составляет сущность метода генетическо­го (гибридологического) анализа. Генетический анализ — основной и специфический метод генетики.В результате скрещивания растений или животных, имеющих по тем или иным признакам наследственные различия, получаются гибридные организмы, или гибриды. Скрещивания, в которых ро­дительские формы отличаются по одной паре признаков, называ­ются моногибридными, при различии по двум парам признаков — дигибридными, а если число признаков больше — полигибридными. Изучение явлений наследственности Г. Мендель начал с про­стейших моногибридных скрещиваний, а затем проводил гибриди­зацию сортов, различающихся по двум и большему числу призна­ков. Успешное применение метода генетического анализа позволило Менделю сформулировать ряд важнейших закономерностей и пра­вил, которым подчиняется наследование признаков и свойств всех организмов при внутривидовой гибридизации. Правило единообразия гибридов первого поколения. При опы­лении красноцветкового гороха пыльцой, взятой с растений с белы­ми цветками, все гибриды первого поколения имели красную ок­раску цветков Такие же результаты были получены при обратном скрещивании, когда белоцветковые растения опылялись пыльцой красноцветковых. Следовательно, все гибридные расте­ния первого поколения имели одинаковую красную окраску цвет­ков, т. е. были по этому признаку единообразны. Единообразие гибридов первого поколения наблюдалось Г. Мен­делем во всех скрещиваниях, которые он проводил. Почти во всех скрещиваниях, которые проводил Г. Мендель, доминантный признак полностью подавлял проявление рецессивно­го, поэтому гибриды первого поколения были единообразны между собой и с родительской формой, имеющей доминантный признак. Но при скрещивании крупнолистного сорта гороха с мелколистным гибриды первого поколения имели листья средней величины. Сле­довательно, доминирование в данном случае было неполным, и наследование по этим признакам носило промежуточный харак­тер. Очень хорошо явление неполного доминирования проявляется у львиного зева (Antirrhinum majus) и ночной красавицы (Mira-bilis jalapa). У них гибриды от скрещивания красноцветковых рас­тений с белоцветковыми имеют промежуточную розовую окраску