1. МЕТОДЫ

Метод клеточных культур: в камеру, наполненную питательной средой, помещают кусочек живой ткани. Через некоторое время на периферии такого кусочка начинается деление и рост клеток. В другом случае вырезанный кусочек ткани слегка обрабатывают раствором фермента трипсина, что приводит к полному разобщению клеток друг от друга. Затем взвесь отмытых клеток помещают в сосуд с питательной средой, где они начинают размножаться, образуя сначала колонии, а затем сплошной клеточный пласт.

Методы микрохирургии: с помощью прибора микроманипулятора клетки разрезают, извлекают из них части, вводят вещества и т.д.

Метод флуоресцентной микроскопии: ряд веществ обладает способностью светиться при поглощении световой энергии. Например, выделенный хлорофилл при освещении в ультрафиолетовых лучах светится красным цветом. Этот принцип используется в флуоресцентной микроскопии: рассматривание флуоресцирующих объектов в зоне коротких длин волн. Флуорохром акридиновый оранжевый связывается в мономерной форме с ДНК – зеленый цвет(ядро), в димерной форме с РНК – красный(цитоплазма и ядрышки)

Метод цитофотометрии: основу его составляет определение количества химических веществ по поглощению ими света определенной длины волны. Интенсивность поглощения лучей пропорциональна концентрации вещ-ва при одной и той же толщине объекта. См. р-цию Фельгена

Иммунохимические р-ции: на белок интереса получают сыворотки, содержащие антитела. Очищенные антитела соединяют с флуорохромами. По свечению флуорохрома находят места локализации искомых белков. Чтобы меченые антитела проникли в клетку, необходимо плазм.мемб. сделать проницаемой путем фиксации клетки и частичной экстракции липидов из мембраны.

Метод радиоавтографии – регистрации веществ, меченных изотопами. Клеткам в среду вводится предшественник одного из макромолекулярных соединений (например, аминокислота или нуклеотид), один из атомов которого замещен радиоактивным изотопом. В процессе синтеза в биополимер включится и меченая молекула предшественника. Регистрировать ее место в клетке можно с помощью фотоэмульсии. (В-частицы активируют зерна AgBr. При фиксации препарата незасвеченные гранулы растворяются; остаются зерна серебра, которые располагаются напротив мест, где содержатся меченые вещ-ва. Используют мелкозернистую фотоэмульсию и изотопы с малой энергией В-частиц)

Метод молекулярной гибридизации: раствор с меченной нуклеиновой кислотой или с ее фрагментом наносят на препарат, предварительно обработанный так, чтобы денатурировать ДНК в составе хромосом или ядер, что достигается щелочной или температурной обработкой образца. В процессе ренатурации ДНК происходит образование молекулярного гибрида между меченой нуклеиновой кислотой из раствора и комплементарным ему участком ДНК в препарате. Место такой гибридизации определяется радиоавтографически.

Для фиксации используются альдегиды и спирты. Также фиксаторы с пикриновой кислотой, фиксатор Буэна, уксусная к-та, формалин, фиксаторы, содержащие OsO₄(хорошо сохраняет липиды).

После фиксации кусочки обезвоживают в спиртах возрастающей концентрации, спирт замещают ксилолом, а ксилол – парафином. Далее нарезают на микротоме.

Срезы на предметное стекло: парафин растворяется в ксилоле, ксилол удаляется спиртами, которые замещаются водой. Для приготовления постоянных препаратов срезы снова обезвоживают. Заливаются канадским бальзамом под покровным стеклом.

Натуральные красители (гематоксилин, кармин и др.) употребляют в сочетании с протравами (окислы различных металлов), с которыми они образуют комплексные соединения (лаки).

Синтетические красители подразделяют на кислые (эозин – розовая цитоплазма) и основные (гематоксилин – фиолетовое ядро).

2. Световая микроскопия

СМ представляет собой оптическую систему из конденсатора, объектива и окуляра. Пучок света от источника освещения собирается в конденсаторе и, пройдя через объект, попадает в систему линз объектива; они строят первичное изображение, которое увеличивается с помощью линз окуляра.

Главной характеристикой микроскопа как оптической системы является разрешающая способность.



d = 0,61 -----------

n sin 

Но все же в световом микроскопе можно видеть частицы меньшей величины, чем 0,2 мкм. Это метод «темного поля». Суть его в том, что в клетке при боковом освещении светятся мельчайшие частицы, отраженный свет от которых попадает в объектив микроскопа. Этот метод успешно применяется при изучении живых клеток.

Если же необработанные живые или мертвые клетки рассматривать в проходящем свете, то в них различаются только крупные детали из-за того, что они обладают иным коэффициентом преломления и поглощения световых лучей, чем окружающая среда. Большая же часть клеточных компонентов мало отличается по этим свойствам как от среды, так и друг от друга и поэтому мало заметны и не контрастны. Для их изучения приходится изменять освещенность или применять особые методы и приборы.

Метод фазово-контрастной микроскопии: отдельные участки прозрачной клетки отличаются друг от друга по плотности и по светопреломлению. Проходя через них, свет изменяет свою фазу, которая зависит от величины амплитуды световой волны. В фазово-контрастном микроскопе в объектив вмонтирована специальная пластинка, проходя через которую луч света испытывает дополнительный сдвиг фазы колебаний. При построении изображения взаимодействуют уже лучи, находящиеся в одной фазе либо в противофазе, но обладающие разной амплитудой; тем самым создается светло-темное контрастное изображение объекта.

Интерференционный микроскоп: пучок параллельных световых лучей от осветителя разделяется на два потока. Один из них проходит через объект, другой идет, минуя объект. В призмах объектива оба потока вновь соединяются и интерферируют между собой. В результате интерференции будет строиться изображение, на котором участки клетки, обладающие разной толщиной или разной плотностью, будут отличаться друг от друга по степени контрастности.

Поляризационный микроскоп: перед конденсором помещается поляризатор, который пропускает световые волны с определенной плоскостью поляризации. После препарата и объектива помещается анализатор, который может пропускать свет с этой же плоскостью поляризации. Поляризатор и анализатор – это призмы, сделанные из исландского шпата (призмы Николя). Если вторую призму (анализатор) повернуть затем на 90^о по отношению к первой, то свет проходить не будет. В том случае, когда между такими скрещенными призмами будет находиться объект, обладающий двойным лучепреломлением, т.е. способностью поляризовать свет, он будет виден как светящийся на темном поле

Конфокальный сканирующий световой микроскоп: получают серии последовательных оптических срезов, взятых с различной глубины и изображения которых накапливаются в компьютере, и по специальной программе реконструируется трехмерное, объемное, изображение объекта. Обычно используются объекты, окрашенные флуорохромами.