3 Вопрос (Методы микроскопии: люминесцентная, темнопольная, фазово-контрастная, электронная).

1. Фазово-контрастная микроскопия основана на превращении изменения по фазе, возникающего при прохождении световой волны через так называемые фазовые (прозрачные) объективы, в изменения по амплитуде, которые улавливаются глазом. С помощью фазово-контрастного приспособления фазовые изменения световых волн, проходящих через объект, превращаются в амплитудные, и прозрачные объекты становятся видимыми в микроскоп. Прозрачные биологические объекты при фазово-контрастной микроскопии приобретают высокую контрастность изображения, которая может быть позитивной и негативной. Фазово-контрастная микроскопия позволяет наблюдать не только фазовые объекты целиком, но и детали строения, например, живых клеток и микроорганизмов.

2. Люминесцентная (или флюоресцентная) микроскопия основана на явлении фотолюминесценции. Первичная (собственная) люминесценция наблюдается без предварительного окрашивания объекта. Вторичная (наведенная) люминесценция возникает после окраски препаратов специальными люминесцирующими красителями – флюорохромами.. Поглощая короткие УФ-волны, объект излучает более длинные волны видимой части спектра. Вследствие этого разрешающая способность микроскопа повышается. Это дает возможность исследовать более мелкие частицы. Чаще используют красители – флюорохромы: акридин оранжевый, аурамин, корифосфин.

3. Темнопольная микроскопия основана на явлениях рассеяния света при сильном боковом освещении взвешенных в жидкости частиц. Она осуществляется с помощью обычного светового микроскопа, снабженного специальными конденсорами, которые создают полный конус света. Вершина этого конуса совпадает с объектом. На темном поле препарата наблюдаются ярко светящиеся контуры микробных клеток и других частиц. Микроскопия в темном поле позволяет определить форму микроба и его подвижность.

4. Электронная микроскопия делает возможным наблюдение объектов, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности светового микроскопа (0,2 мкм). Источником электронов является раскаленная вольфрамовая нить. Роль линз в электроном микроскопе выполняет круговое магнитное поле. Электронный микроскоп применяется для изучения вирусов, тонкого строения различных микроорганизмов, макромолекулярных структур и других субмикроскопических объектов.

4 Вопрос (Этапы приготовления микропрепаратов из культур м/о. Способы окраски).

Этапы приготовления микропрепаратов из культуры микробов:

1. Обезжирить предметное стекло (мылом или смесью Никифорова)

2. Прокалить бактериальную петлю и нанести на стекло 2-3 капли физиологического раствора

3. прокалить бактериальную петлю, обжечь край пробиркис культурой микроба, взять касательным движением петли микроорганизм из питательной среды

4. внести микроб в физиологический раствор и равномерно распределить в нем

5. высушить мазок на воздухе

6. зафиксировать мазок на огне или в смеси Никифорова

7. окрасить мазок

Для окраски препарата в микробиологической практике используются крастели:

1. кислые (кислый фуксин, эозин, пикриновая кислота)

2. основные (генциановый фиолетовый, метиленовый синий, основный фуксин, везувин)

Способы окраски:

1. негативные (окрашивается фон мазка, и тогда на нем хорошо видны неокрашенные бактериальные клетки)

2. позитивные (окрашиваются сами бактериальные клетки, хорошо видимые на неокрашенном фоне мазка):

а) Простые (мазок окрашивается каким-то одним красителем, 1-2 минуты. После окрашивания краситель сливают, препарат промывают и высушивают. Позволяет выявить наличие или отсутствие микроорганизма, его форму, расположение клеток, определить размеры)

б) Сложные (используются два и более красителей. Позволяет выявить химические и структурные особенности микроорганизма. Например: окраска по Грамму, По Нейссеру, Метод Бури-Гинса).