2.3.2. Дифференциация родов

Небольшое число признаков, выявляемых у культур энтеробактерий на этапе первичной идентификации, не позволяет достоверно определить их родовую принадлежность. Обычно по сочетанию биохимических признаков на средах первичной идентификации (на комбинированных) можно заподозрить одновременно несколько (3 - 6) родов энтеробактерий. В связи с этим для установления родовой принадлежности изучаемой культуры следует провести дифференциацию родов, т.е. использовать соответствующие тесты из минимального дифференцирующего ряда (табл. 7). Конкретный набор тестов определяют с учетом родов, подлежащих дифференциации (табл. 5). При затруднениях в дифференциации прибегают к определению дополнительных признаков у изучаемой культуры, используя данные о биохимических характеристиках родовых групп семейства Enterobacteriaceae (табл. 8).

Таблица 7

ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ РОДОВЫХ ГРУПП ENTEROBACTERIACEAE

ПО БИОХИМИЧЕСКИМ СВОЙСТВАМ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ МИНИМАЛЬНОГО

ДИФФЕРЕНЦИРУЮЩЕГО РЯДА

┌────────────────────────┬──────┬─────┬──────┬──────┬───────┬───────┬──────┬──────┬────┬──────┬───────┬───────┐

│ Тест или субстрат │Esche-│Shi- │Salmo-│Citro-│Klebsi-│Entero-│Hafnia│Serra-│Pro-│Ter- │Edward-│Erwinia│

│ │richia│gella│nella │bacter│ella │bacter │ │tia │teus│sinia │siella │<*****>│

│ │ │ │ │ │<***> │ │ │ │ │<****>│ │ │

├──────┬─────────────────┼──────┼─────┼──────┼──────┼───────┼───────┼──────┼──────┼────┼──────┼───────┼───────┤

│Комби-│Сероводород │- │- │+, - │+, - │- │- │- │- │+, -│- │+ │- │

│ниро- │Лактоза <*> │+, - │- │-, + │X │+ │+ │-, + │-, + │- │- │- │X │

│ванная│Глюкоза (газ) <*>│+, - │- │+, - │+ │+ │+ │+, - │-, + │+, -│- │+ │- │

│среда │Мочевина │- │- │- │X │- │(+), - │- │X │+, -│+, (+)│- │- │

├──────┼─────────────────┼──────┼─────┼──────┼──────┼───────┼───────┼──────┼──────┼────┼──────┼───────┼───────┤

│Мини- │Мочевина (по │- │- │- │X │(+), + │(+), - │- │X │+, -│+ │- │- │

│маль- │Преусу или │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ный │Кристенсену) <**>│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│диффе-│Подвижность │+, - │- │+, - │+ │- │+ │X │+ │+, -│- │+ │+ │

│ренци-│Индол │+, - │-, + │- │-, + │-, + │- │- │- │+, -│X │+ │- │

│рующий│Фенилаланиндеза- │- │- │- │- │- │- │- │- │+ │- │- │X │

│ряд │миназа │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ │Цитрат Симонса │- │- │+, - │+ │+ │+ │X │+ │X │- │- │+ │

│ │Ацетат натрия │+, (+)│- │X │X │+ │+ │-, (+)│X │X │X │X │X │

│ │Лизиндекарбокси- │+, - │- │+, - │- │+ │-, + │+ │+ │- │- │+ │- │

│ │лаза │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ │Орнитиндекарбо- │X │-, + │+ │X │- │+ │+ │+ │-, +│X │+ │- │

│ │ксилаза │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ │ │реакция с │+ │+ │+ │+ │-, + │- │+ │X │+ │+ │+ │- │

│ │ │метиловым │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ │Среда │красным │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ │Кларка│реакция │- │- │- │- │+, - │+ │X │X │- │- │- │X │

│ │ │Фогеса - │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ │ │Проскауэра│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ │Сорбит │X │X │+ │+ │+ │+ │- │+ │-, +│X │- │X │

└──────┴─────────────────┴──────┴─────┴──────┴──────┴───────┴───────┴──────┴──────┴────┴──────┴───────┴───────┘

--------------------------------

<*> При получении на комбинированной среде нечетких результатов эти тесты повторяют на отдельных средах (жидкие или полужидкие среды с лактозой, глюкозой).

<**> При отсутствии этого субстрата в комбинированной среде или при получении на ней нечетких результатов.

<***> Klebsiella pneumoniae.

<****> Tersinia pestis.

<*****> Erwinia herbicola.

Таблица 8

РАСШИРЕННАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БИОХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

РОДОВЫХ ГРУПП ENTEROBACTERIACEAE

┌───────────────┬──────┬──────┬──────┬──────┬───────┬───────┬───────┬───────┬───────┬────┬───────┬──────┐

│ Тест или │Esche-│Shi- │Salmo-│Citro-│Edward-│Klibsi-│Entero-│Hafnia │Serra- │Pro-│Ter- │Erwi- │

│ субстрат │richia│gella │nella │bacter│siella │ella │bacter │ │tia │teus│sinia │nia │

│ │ │ │ │ │ │<**> │ │ │ │ │<***> │<****>│

├───────────────┼──────┼──────┼──────┼──────┼───────┼───────┼───────┼───────┼───────┼────┼───────┼──────┤

│Цитрат Симонса │- │- │+, - │+ │- │+ │+ │X (37°)│+ │X │- │+ │

│ │ │ │ │ │ │ │ │<*> │ │ │ │ │

│ │ │ │ │ │ │ │ │+ (22°)│ │ │ │ │

│Мочевина │- │- │- │X │- │(+), + │(+), - │- │X │+, -│+ │- │

│Малонат натрия │- │- │-, + │-, + │- │+ │+, - │X │- │- │- │X │

│Фенилаланинде- │- │- │- │- │- │- │- │- │- │+ │- │X │

│заминаза │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│Сероводород │- │- │+, - │+, - │+ │- │- │- │- │+, -│- │+ │

│Подвижность │+, - │- │+, - │+ │+ │- │+ │X (37°)│+ │+, -│- (37°)│+, - │

│ │ │ │ │ │ │ │ │+ (22°)│ │ │+ (22°)│ │

│Индол │+, - │-, + │- │-, + │+ │-, + │- │- │- │+, -│- │- │

│Реакция с ме- │+ │+ │+ │+ │+ │-, + │- │+ (37°)│+ (37°)│+ │+ │- │

│тиловым красным│ │ │ │ │ │ │ │- (22°)│ │ │ │ │

│Реакция Фогеса │- │- │- │- │- │+, - │+ │X (37°)│X (37°)│- │- │X │

│- Проскауэра │ │ │ │ │ │ │ │+ (22°)│ │ │ │ │

│Лизиндекарбок- │+, - │- │+, - │- │+ │+ │-, + │+ │+ │- │- │- │

│силаза │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│Аргининдигидро-│X │-, + │(+), +│X │- │- │+, - │- │- │- │- │- │

│лаза │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│Орнитиндекарбо-│X │-, + │+ │X │+ │- │+ │+ │+ │-, +│X │- │

│ксилаза │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│Глютаминовая │+ │+ │- │- │* │- │- │- │- │+ │* │* │

│кислота │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│Желатин │- │- │-, (+)│- │- │- │-, (+) │- │+ │X │- │+ │

│КСИ │- │- │-, + │+ │- │+ │+ │+ │+ │+ │- │X │

│Ацетат натрия │+, (+)│- │X │X │X │+ │+ │-, (+) │X │X │X │X │

│Цитрат │X │- │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │X │* │* │

│Кристенсена │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│Целлобиоза │- │- │X │X │- │+ │+ │X │X │X │+ │X │

│Газообразование│+, - │-, + │+, - │+ │+ │+ │+ │X │X │X │- │- │

│из глюкозы │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│Адонит │-, + │- │- │- │* │+ │X │- │X │-, +│X │- │

│Арабиноза │X │X │+ │+ │- │+ │+ │+ │- │- │X │+ │

│Глицерин │+ │X │+ │+ │* │+ │-, + │+ │+ │+ │* │X │

│Дульцит │X │X │+, - │X │- │-, + │X │- │- │- │- │- │

│Инозит │-, + │- │X │-, + │- │+ │-, + │- │X │-, +│X │* │

│Ксилоза │X │X │X │+ │* │+ │+ │+ │X │+, -│X │X │

│Лактоза │X │-, (+)│-, + │X │- │+ │+ │X │-, + │- │- │X │

│Мальтоза │X │X │+ │+ │* │+ │+ │+ │+ │+, -│+ │+ │

│Маннит │+ │+, - │+ │+ │- │+ │+ │+ │+ │-, +│+ │+ │

│Рамноза │X │X │X │+ │- │+ │+ │+ │- │X │+, - │+ │

│Рафиноза │X │X │-, + │X │- │+ │+ │- │- │- │- │* │

│Салицин │X │- │- │X │- │+ │X │X │+ │X │+, - │X │

│Сахароза │X │- │- │+ │- │+ │+ │X │+ │X │-, + │X │

│Сорбит │X │X │+ │+ │- │+ │+ │- │+ │-, +│X │X │

└───────────────┴──────┴──────┴──────┴──────┴───────┴───────┴───────┴───────┴───────┴────┴───────┴──────┘

--------------------------------

<*> Температура указана по Цельсию (C).

<**> Приведены свойства, характерные для K. pneumoniae.

<***> Приведены свойства без T. pestis.

<****> Приведены свойства, характерные для Erwinia herbicola.

Примечание: * - не изучено.

Воспроизведение тестов минимального дифференцирующего ряда требует соблюдения известных правил.

При определении подвижности посев культуры следует делать уколом петлей или иглой по центру столбика полужидкого СПА (0,3 - 0,4%), не доходя до дна пробирки.

Индолообразование определяют путем добавления реактивов Эрлиха или Ковача к культуре, выращенной в безуглеводной среде - пептонной воде (1 - 2%), бульоне Хоттингера, бульоне на триптическом переваре казеина. Вместо растворов реактивов Эрлиха или Ковача можно использовать пропитанную одним из них полоску фильтровальной бумаги (индикаторная бумажка "на индол"), которую помещают между стенкой и пробкой пробирки с культурой, выращенной в какой-либо из указанных сред или в полужидком агаре, используемом для определения подвижности. Все указанные для определения индолообразования питательные среды следует предварительно проверять с тест-культурами, образующими индол.

Для выявления фенилаланиндезаминазы делают массивный посев штрихом по

скошенной части соответствующей среды и после 18 - 24 часов инкубации на

выросшую культуру наносят несколько капель 10% раствора железа (III)

хлорида (FeCl ).

3

При определении декарбоксилаз лизина и орнитина, дигидролазы аргинина наряду с посевами в среды с этими аминокислотами необходимо делать посев в контрольную пробирку, содержащую основу без аминокислоты. После посевов во все пробирки, включая контрольную, вносят стерильное вазелиновое масло слоем 4 - 5 мм.

Тесты со средами Симонса и ацетатной выявляют способность испытуемых культур использовать цитрат и ацетат (соответственно) как единственные источники углерода. Для посева на эти среды берут минимальную инокулирующую дозу, снимая посевной материал без прикосновения петли к среде культивирования. Более целесообразно использовать для посева на эти среды суспензию бактериологической петли культуры в 1 - 1,5 мл ИХН, не допускается высев из бульона и других жидких питательных сред.

Для постановки тестов с метиловым красным и Фогеса - Проскауэра используют среду Кларка в объеме 5 - 6 мл в пробирке, посев делают обычным способом. Первоначальный учет проводят через сутки, для чего по 1 мл культивированной жидкости переносят в две пробирки, в одну из которых добавляют 1 - 2 капли реактива метилового красного, а во вторую - последовательно 0,5 мл 6% спиртового раствора альфа-нафтола и 0,2 мл 40% раствора KOH. Оценку результатов реакций см. табл. 9. Тест с метиловым красным учитывают сразу после добавления реактива, а тест Фогеса - Проскауэра - в течение 5 - 10 минут после встряхивания или после 1 - 2 часов пребывания в термостате. Пробирку с неиспользованной культурой в среде Кларка продолжают инкубировать в термостате до 2 - 4 суток, когда указанные реакции дают более четкие результаты. Для некоторых энтеробактерий (например, гафний) результаты реакций с метиловым красным и Фогеса - Проскауэра различны при разных температурах культивирования (22° или 37 °C), что может быть использовано в качестве дополнительного дифференцирующего теста.

Таблица 9

РЕЗУЛЬТАТЫ ОСНОВНЫХ БИОХИМИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ

НА КОМБИНИРОВАННЫХ СРЕДАХ И МИНИМАЛЬНОМ ДИФФЕРЕНЦИРУЮЩЕМ

РЯДЕ

┌─────────────────┬────────────────────────────────────────────────────┬────────────┐

│Тест или субстрат│Реакция через 18 - 24 часа культивирования при 37 °C│Максимальные│

│ ├─────────────────────────┬──────────────────────────┤сроки учета │

│ │ положительная │ отрицательная │результатов │

│ │ │ │ в случаях │

│ │ │ │замедленных │

│ │ │ │ реакций │

│ │ │ │ (в сутках) │

├─────────────────┼─────────────────────────┼──────────────────────────┼────────────┤

│Подвижность │помутнение среды, │среда остается прозрачной,│2 (с инкуба-│

│ │диффузное или в отдельных│рост строго по ходу укола │цией посевов│

│ │участках вдоль укола │ │при 22 °C) │

│Сероводород (в │почернение в разной сте- │отсутствие почернения в │ │

│среде Олькеницко-│пени по всей среде или в │среде │ │

│го или Клиглера) │отдельных участках │ │ │

│Индол (с примене-│покраснение индикаторной │отсутствие изменения цвета│ │

│нием индикаторной│бумажки │индикаторной бумажки │ │

│бумажки) │ │ │ │

│Фенилаланиндеза- │зеленое окрашивание │отсутствие изменения цвета│ │

│миназа │агаровой поверхности │ │ │

│ │среды после добавления │ │ │

│ │нескольких капель 10% │ │ │

│ │раствора железа (III) │ │ │

│ │хлорида (FeCl ) │ │ │

│ │ 3 │ │ │

│Мочевина по │синее окрашивание среды │пожелтение среды │2 │

│Преусу <*> │ │ │ │

│Мочевина по │малиновое окрашивание │отсутствие изменения цвета│4 │

│Кристенсену │среды │ │ │

│Ацетат натрия <*>│наличие роста и синее │отсутствие роста и │4 (редко до │

│ │окрашивание среды │изменения цвета среды │7) │

│Цитрат Симонса │наличие роста и синее │отсутствие роста и │4 (редко до │

│<*> │окрашивание среды │изменения цвета среды │14) │

│Реакция с │красное окрашивание среды│желтое окрашивание среды │2 - 4 │

│метиловым красным│после добавления реактива│после добавления реактива │ │

│в среде Кларка │метилового красного │метилового красного │ │

│Реакция Фогеса - │вишневое окрашивание │отсутствие изменения цвета│2 - 4 │

│Проскауэра │среды после добавления │среды после добавления │ │

│ │реактивов (альфа-нафтола │реактивов (альфа-нафтола и│ │

│ │и KOH) │KOH) │ │

│Среды с аминокис-│синее (при индикаторе │отсутствие синего (фиоле- │4 │

│лотами (лизином, │бромтимол синий) или │тового) окрашивания сред с│ │

│орнитином, │фиолетовое (при индикато-│аминокислотами, желтое │ │

│аргинином) │ре бромкрезол пурпуровый)│окрашивание в контрольной │ │

│ │окрашивание среды при │пробирке │ │

│ │отсутствии указанных │ │ │

│ │окрашиваний в контрольной│ │ │

│ │пробирке │ │ │

│Малонат натрия │синее окрашивание среды │отсутствие изменения цвета│2 │

│<*> │ │ │ │

│Цитрат │розово-красное │отсутствие изменения цвета│4 │

│Кристенсена │окрашивание среды │ │ │

│Желатин │разжижение среды, не │отсутствие разжижения │30 │

│ │исчезающее после часового│среды или его исчезновение│ │

│ │охлаждения в рефрижерато-│после часового охлаждения │ │

│ │ре (4 - 6 °C) │в рефрижераторе (4 - 6 °C)│ │

│Среды с │синее или розовое, │отсутствие изменения цвета│30 │

│углеводами │красное (в зависимости от│ │ │

│ │индикатора) окрашивание │ │ │

│ │среды │ │ │

└─────────────────┴─────────────────────────┴──────────────────────────┴────────────┘

--------------------------------

<*> Указаны изменения цвета при индикаторе бромтимоловый синий.

Посевы для воспроизведения других тестов не требует специальных пояснений, учет результатов см. табл. 9.

На этапе дифференциации родов могут быть использованы пробы с поливалентными сальмонеллезными и дизентерийным бактериофагами (диагностические жидкие или лечебные в таблетках). Таблетку лечебного фага перед постановкой пробы растворяют в 20 мл ИХН. Для воспроизведения пробы с фагом используют 2-х или 18-часовую бульонную культуру, можно применять также взвесь суточной агаровой культуры в ИХН. Тонко оттянутой пастеровской пипеткой или петлей диаметром 4 - 5 мм наносят две капли испытуемой культуры на хорошо подсушенный СПА в чашке Петри. На одну из капель после подсыхания наносят петлей или из очень тонкого капилляра пастеровской пипетки каплю фага, а на другую (служащую контролем) - каплю стерильного бульона. Бактериофаг применяют в неразведенном виде или в разведениях в соответствии с "Наставлением" к препарату. После постановки пробы чашки инкубируют при 37 °C в течение 18 - 20 часов. При положительной реакции на месте нанесения фага появляется четко очерченный лизис (++++), полусливной лизис (+++), большее или меньшее число отдельных негативных колоний (++, +). При отсутствии лизиса (отрицательная реакция) в местах нанесения фага, как и в контроле, наблюдают сплошной рост культуры.

Как указывалось ранее, на этапе дифференциации родов возможна постановка ориентировочных серологических проб с поливалентными агглютинирующими сыворотками к сальмонеллам и шигеллам. При этом используют соответственно поливалентную смесь к сальмонеллам групп ABCDE (при отрицательном результате пробу повторяют со смесью O-сывороток к сальмонеллам редких групп) и поливалентную смесь сывороток к S. sonnei, S. flexneri 1 - 5, S. flexneri 6. Указанные ориентировочные пробы выполняют путем постановки реакции агглютинации на стекле с культурой, выросшей на среде первичной идентификации. В ходе исследования на ЭПЭ, как указывалось ранее, при отборе соответствующих колоний, давших агглютинацию с OKA сывороткой, делают посев не только на среду первичной идентификации, но и на скошенный СПА. Серологическое изучение эшерихий проводят с культурами, выращенными на скошенном СПА. Культуры, подозреваемые на принадлежность к ЭПЭ, исследуют повторно с поливалентной сывороткой OKA и при положительном результате с OKB, OKC, OKD, OKE или соответствующими OK-иммуноглобулинами. При наличии положительной реакции культуру засевают в среды минимального дифференцирующего ряда (табл. 7) для подтверждения принадлежности культуры к роду Escherichia (в первую очередь ацетатную, цитратную Кристенсена и на подвижность).

Помимо постановки тестов, необходимых для установления родовой принадлежности выделенной культуры энтеробактерий, со среды первичной идентификации делают также высев на скошенный СПА, используемый для дальнейшей биохимической и серологической идентификации.