4.5. Типирование шигелл по чувствительности к колицинам

Чувствительность S. sonnei и других видов шигелл к колицинам (колициновар) связано со способностью бактерий адсорбировать на рецепторах поверхности клетки определенные колицины; колицины (или группа родственных колицинов) адсорбируются на строго специфических рецепторах.

Этот метод применяют к разным видам шигелл (в целом занимающих одно из первых мест по чувствительности к колицинам среди всех родов энтеробактерий), т.к. они мало отличаются по удельному весу колициночувствительных штаммов. Вместе с тем использование этого метода в эпидемиологических целях ограничено из-за относительной нестабильности колициноваров.

Для определения колициноваров используют 11 эталонных колициногенных штаммов из коллекции P. Frederiq. Перечень их представлен в таблице 51. Перед началом исследования готовят чашки с 1,5-процентным СПА, разливая его по 20 - 25 мл на чашку с добавлением генцианвиолета (2 - 4 капли 0,1-процентного водного раствора на 100 мл среды). Определение проводят в двух (дублирующих) чашках. Дно каждой чашки со средой разделяют на 11 квадратов - по числу эталонных штаммов, обозначая их условно 1, 2, 3 и т.д. соответственно порядковому номеру при использовании этих штаммов. В квадраты сеют последовательно уколом петли суточные бульонные культуры указанного набора колициногенных штаммов. Чашки с посевами инкубируют при 37 °C в течение 22 - 24 часов, затем обеззараживают однократно хлороформом, как было описано выше (удаление обезвреженной бактериальной массы не требуется). По окончании этой процедуры 2 капли 6-часовой бульонной культуры исследуемого штамма вносят в пробирку с 2,5 мл расплавленного и охлажденного до 46 - 48 °C полужидкого (0,7%) СПА и после перемешивания агар наслаивают на 1-й слой агара. В результате предшествовавшего культивирования посевов эталонных колициногенных штаммов в толще 1-го слоя агара колицины диффундировали в среду вокруг макроколоний.

Таблица 51

ЭТАЛОННЫЕ КОЛИЦИНОГЕННЫЕ ШТАММЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ

КОЛИЦИНОВАРОВ ШИГЕЛЛ P. FREDERIQ)

┌────────────────────────────────┬───────────────────────────────┐

│ Наименование штамма │ Продуцируемый колицин │

├────────────────────────────────┼───────────────────────────────┤

│E. coli CA-18 │B │

│E. coli CA-23 │D │

│E. coli CA-38 │E+I │

│E. coli CA-42 │Y │

│E. coli CA-53 │I │

│E. coli K-235 │K │

│E. coli CA-62 │J+I │

│E. coli CA-7 │V │

│S. boydii P-1 │S │

│ │ I │

│S. boydii P-9 │S +I │

│ │ 3 │

│B. dispar P-14 │S │

│ │ 5 │

└────────────────────────────────┴───────────────────────────────┘

Через 16 - 20 часов инкубации при 37 °C вокруг макроколонии эталонных штаммов во 2-ом слое агара образуются зоны задержки роста испытуемого штамма, если он колициночувствителен. Штамм считают чувствительным, если величина зоны задержки его роста, измеряемой от края макроколонии эталонного колициногенного штамма до наружного края зоны, составляет 2 мм.

При оценке результатов учитывают степень чувствительности к колицинам по системе 4 полюсов: зона до 2 мм "+", от 2 до 5 мм "++", от 4 до 10 мм "+++" и более 10 мм "++++". Для получения четких результатов имеет значение использование правильно приготовленной агаровой среды, особенно в отношения количественного содержания в среде агара (1,5%), в более плотной среде диффузия колицинов в агар замедляется. Важно также обеспечить равномерное распределение инокулята во 2-ом слое (полужидкого) агара.

Изучение спектра лизиса проводят в обеих чашках, если он однороден, типирование считают законченным. При расхождении результатов исследование повторяют. Дублированное исполнение процедур по колицинотипированию диктуется необходимостью исключения технических погрешностей, могущих влиять на спектр чувствительности к колицинам исследуемого штамма.

Установленный колициновар отражает спектр колицинов, к которым исследуемый штамм оказался чувствительным (табл. 51).