Тема 2. Ферменти

1. Швидкість хімічних реакцій. Сутність явища каталізу. Особливості ферментативного каталізу.

2.Класифікація й номенклатура ферментів. Хімічна природа ферментів, їхні функціональні групи. Активний й алостеричний центри. Коферменти, простетичні групи. Роль вітамінів, металів й інших кофакторів у функціонуванні ферментів. Множинні форми ферментів.

3.Загальні уявлення про кінетику й механізм ферментативних процесів. Специфічність дії ферментів. Вплив різних факторів середовища на ферментативні процеси (температури, концентрації водневих іонів й ін.). Активатори та інгібітори. Локалізація ферментів у клітині.

1. Швидкість хімічних реакцій. Сутність явища каталізу. Особливості ферментативного каталізу.

Швидкість хімічних реакцій

швидкість реакції визначається як зміна концентрації реагуючих речовин, що відбувається за одиницю часу. Швидкість реакції залежить від будови молекул реагуючих речовин, їхньої концентрації, температури, тиску, наявності каталізаторів і деяких інших факторів.

Сутність явища каталізу.

Реакція стає можливою тільки при зіткненнях молекул. Чим більше молекул в одиниці об'єму, тим частіше вони зіштовхуються одна з одною, тим швидше перетворяться. Однак, не кожне зіткнення реагуючих молекул приводить до їхньої зміни. Щоб реакція почалася, молекули повинні мати певний запас енергії, необхідним для подолання енергетичного бар'єра, що створюється міжмолекулярними силами відштовхування й внутрішньомолекулярними силами зчеплення (міцністю хімічних зв'язків). Особливо багато енергії потрібно для розриву ковалентних зв'язків, що переважають у молекулах органічних речовин. Коли енергетичний бар'єр переборений і реакція почалася, у ході її може виділитися значно більше енергії, чим витрачено на початок процесу. Зміни енергії, що відбуває в ході хімічних реакцій може бути зображене графічно. Кількість енергії, необхідна грам-молекулі реагуючої речовини для вступу в реакцію, називається енергією активації й розраховується в Кдж/моль.

Чим більше в речовині активних (збуджених) молекул, здатних перебороти енергетичний бар'єр, тим вище швидкість його хімічних перетворень. У звичайних умовах тільки незначна частина молекул речовини перебуває в активному стані. Активація їх відбувається при збільшенні температури, концентрації реагуючих речовин, збільшенні тиску (якщо це газоподібні речовини).

У живих організмах великі коливання температури й тиску неможливі, тому більшість хімічних реакцій у живих організмах іде за участю ферментів (або біологічних каталізаторів), які знижують енергію активації реагуючих молекул у багато разів за рахунок зменшення сил відштовхування між молекулами й ослаблення внутрішньомолекулярних зв'язків

Поняття ферменту

Ферменти (від лат. fermentum - шумування, закваска) - це специфічні білки, що є присутніми у всіх живих клітинах де відіграють роль біологічних каталізаторів, тобто прискорюють протікання хімічних реакцій в організмі. Через їхнє посередництво реалізується генетична інформація й здійснюються всі процеси обміну речовин й енергії в живих організмах.

У цей час відомо більше 2000 різних ферментів, з яких багато хто виділені з живих кліток й отримані в індивідуальному стані. Перший кристалічний фермент (уреаза) виділений американським біохіміком Д.Самнером в 1926 р. Для ряду ферментів вивчена послідовність амінокислот і з'ясоване розташування поліпептидних ланцюгів у тривимірному просторі. У лабораторних умовах здійснений штучний хімічний синтез ферменту рибонуклеази.

Діючи в строго певному порядку, ферменти каталізують сотні реакцій, у ході яких розщеплюються молекули поживних речовин, запасається й перетвориться енергія й з молекул - попередників будуються макромолекули, що входять до складу клітини.

Завдяки тонкій координованості між всіма ферментативними реакціями дотримується гармонійна рівновага всіх метаболічних процесів і забезпечується нормальне функціонування живих організмів.

Так, деякі хвороби пов'язані з недостатністю або повною відсутністю деяких ферментів або, навпроти, з надмірністю дії того або іншого ферменту. Вимірюючи активність ферментів у плазмі крові можна діагностувати багато захворювань й оцінювати функціональний стан у спортсменів. У цей час ферменти широко використовуються в медицині (наприклад, травні ферменти у вигляді лікарських препаратів Панзинорм, Фестал і т.д.), у харчовій промисловості (наприклад, амілаза використовується при виробництві морозива, протеаза - при виготовленні ковбас і м'ясних консервів, у хімічній промисловості при виробництві зубних паст використовується каталаза, пральних порошків - амілаза, ліпаза, крім того, амілаза використовується при виготовленні паперу, бавовни, при виробленні шкір).

Особливості ферментативного каталізу.

• Швидкість хімічних реакцій прискорюється ферментами в 10⁶ -10¹⁶ разів, у порівнянні з хімічними каталізаторами.

• Ферменти працюють при нормальній температурі тіла (37-42°) і нормальному тиску

• Здійснюється тонка регуляція ферментативної реакції, немає відходів і шлаків.

• Ферментативні реакції підкоряються термодинамічній кінетиці.

• Ферменти не зміщають рівновагу реакції, а тільки прискорюють його наближення.

2. КЛАСИФІКАЦІЯ Й НОМЕНКЛАТУРА ФЕРМЕНТІВ. ХІМІЧНА ПРИРОДА ФЕРМЕНТІВ, ЇХНІ ФУНКЦІОНАЛЬНІ ГРУПИ. КОФЕРМЕНТИ, ПРОСТЕТИЧНІ ГРУПИ. РОЛЬ ВІТАМІНІВ, МЕТАЛІВ Й ІНШИХ КОФАКТОРІВ У ФУНКЦІОНУВАННІ ФЕРМЕНТІВ. АКТИВНИЙ Й АЛОСТЕРИЧНИЙ ЦЕНТРИ. МНОЖИННІ ФОРМИ ФЕРМЕНТІВ.

Класифікація й номенклатура ферментів.

Ферментологія дуже довго не мала у своєму розпорядженні строго наукову номенклатуру ферментів. Найменування ферментам давали по випадкових ознаках (тривіальна номенклатура), за назвою субстрату (раціональна), по хімічному складі ферменту, нарешті, по типу реакції, що каталізується і характеру субстрату.

Прикладами тривіальної номенклатури можуть служити назви таких ферментів, як пепсин (від греч. пепсис - травлення), трипсин (від греч. трипсис - розріджую) і папаїн (від назви динячого дерева Carica papaja, із соку якого він виділений). По дії всі ці ферменти є протеолітичними, тобто прискорюють гідроліз протеїнів (білків). Характерна назва була дана групі забарвлених внутрішньоклітинних ферментів, що прискорюють окисно-відбудовні реакції в клітині, - цитохроми (від лат. citos - клітина і chroma - цвіт).

Найбільшого поширення одержала раціональна номенклатура, відповідно до якої назва ферменту складається з назви субстрату характерного закінчення -аза. Вона була запропонована більш сторіччя тому тому, у 1883 р. Э. Дюкло - учнем Л. Пастера. Так, фермент, що прискорює реакцію гідролізу крохмаля, одержав назву амілаза (від греч. амілон - крохмаль), гідроліза жирів - ліпаза (від греч. ліпос - жир), білків (протеїнів) - протеаза, сечовини - уреаза (від греч. уреа - мочевина) і т.п.

Коли методами аналітичної хімії були досягнуті відомі успіхи в розшифровуванні хімічної природи простетических груп, виникнула нова номенклатура ферментів. Їх стали іменувати за назвою простетичної групи, наприклад, гемінфермент (простетическая група - гем), піридоксаль-фермент (простетична група - піридоксаль) і т.п.

Потім у назві ферменту стали вказувати як на характер субстрату, так і на тип каталізуємої реакції.

У 1961 р. Международная комісія з номенклатури ферментів представила V Міжнародному біологічному конгресу проект номенклатури, побудований на строго наукових принципах. Проект був затверджений конгресом, і нова номенклатура міцно ввійшла у ферментологію. Відповідно до цього (Московської) номенклатурі назва ферментів складають із хімічної назви субстрату і назви тієї реакції, що здійснюється ферментом. Якщо хімічна реакція, що прискорюється ферментом, супроводжується переносом угруповання атомів від субстрату до акцептору, назва ферменту включає також хімічне найменування акцептора.

У зв'язку зі значним ускладненням наукових назв у новій номенклатурі припускається зберігання поряд із новими старих тривіальних, робітників назв ферментів. Міжнародною комісією був складений детальний список усіх відомих у той час ферменти, істотно доповнений у 1972 р. при перегляді як класифікації, так і номенклатури деяких ферментів, де поруч із новою науковою назвою кожного ферменту приведена стара, а також зазначено хімізм реакції ферменту й у деяких випадках природа ферменту. Таким чином, виключається можливість плутанини в найменуванні ферментів. У 1964 р. список уключав 874 ферменту; у наступний час він був істотно доповнений і зріс до 1770 ферментів у 1972 р. і до 2003 ферментів у 1979 р.

В основу класифікації ферментів був покладений тип реакції, що піддається каталітичному впливу. По цьому принципі всі ферменти ділять на 6 класів.

I. Оксидоредуктази

До класу оксидоредуктаз відносять ферменти, що каталізують реакції окислення - відновлення.

2. Трансферази

Прискорюють реакції переносу функціональних груп і молекулярних залишків від однієї сполуки до іншого. Це один з найбільш великих класів: він нараховує близько 500 індивідуальних ферментів. Залежно від характеру залишків розрізняють фосфотрансферази, амінотрансферази, глікозилтрансферази, ацилтрансферази, трансферази, метилтрансферази, формілтрансферази, і ін.

3. Гідролази

Прискорюють реакції гідролітичного розпаду ефірних, пептидних, глікозидних й ін. зв'язків у молекулах ліпідів, білків, вуглеводів, нуклеотидов. До гідролаз належать всі травні ферменти.

4. Ліази

Прискорюють негідролітичне відщіплення від субстратів певних груп атомів з утворенням подвійного зв'язку (або приєднують групи атомів по подвійному зв'язку):

6. Ізомерази

Прискорюють просторові або структурні перебудови в межах однієї молекули:

6. Лігази

Прискорюють реакції синтезу, спряжені з розпадом багатих енергією зв'язків.

Кожному ферменту в зазначеному списку привласнений індивідуальний номер (шифр). Наприклад, шифр уреаза виражається цифрами 3.5.1.5. Це означає, що уреаза відноситься до 3-го класу (перша цифра) ферментів, усі представники якого каталізуюті реакції гідролизу. Друга цифра (5) говорить про те, що уреаза належить до 5-го підкласу цього класу, куди зараховані усі ферменти, що прискорюють гідроліз С - N-зв'язків, що не є пептидними. Третя цифра шифру (1) указує на приналежність уреази до підпідкласу 5-го підкласу, члени якого прискорюють гідроліз лінійних амідів, а остання цифра (5) - порядковий номер уреази в цьому підпідкласі.

Таким чином, шифр абсолютно точно вказує місце ферменту в загальному списку. В даний час прийнято в наукових публікаціях при першому нагадуванні ферменту вказувати в скобках його шифр.

Хімічна природа ферментів, їхні функціональні групи.

Всі ферменти по хімічній природі є простими або складними білками з великою молекулярною масою (каталаза - 248000 Д, піруват- дегідрогеназа - 4500000 Д). При гідролізі утворюються амінокислоти й, так само як і білки чутливі до дії високих температур, випромінювання, солей важких металів, концентрованих кислот і лугів.

Ферменти можуть бути однокомпонентними, простими білками, що складаються тільки з амінокислот і двокомпонентними, складними білками. У другому випадку в складі ферменту виявляється додаткова група небілкової природи

Коферменти, простетичні групи. Роль вітамінів, металів й інших кофакторів у функціонуванні ферментів.

Найчастіше додаткову групу, міцно зв'язану, не відокремлювану від білкової частини (апоферменту), називають простетичною групою; на відміну від цього додаткову групу, що легко відокремлюється від апоферменту й здатна до самостійного існування, звичайно йменують коферментом.

Хімічна природа найважливіших коферментів була з'ясована в 30-і роки нашого сторіччя завдяки працям О. Варбурга, Р. Куна, П. Каррера й ін. Виявилося, що роль коферментів у двокомпонентних ферментах відіграють більшість вітамінів (Е, ДО, Q, В₁, В₂, В₆, В₁₂, З, Н и ін.) або сполук, побудованих за участю вітамінів (коензим А, НАД⁺ і т.п.). Крім того, функцію коферментів виконують такі сполуки, як НS-глутатіон, численна група нуклеотидів й їхніх похідних, фосфорні ефіри деяких моносахаридів і ряд інших речовин.

Характерною рисою двокомпонентних ферментів є те, що ні білкова частина, ні додаткова група окремо не мають помітну каталітичну активність. Тільки їхній комплекс проявляє ферментативні властивості. При цьому білок різко підвищує каталітичну активність додаткової групи, властиву їй у вільному стані в дуже малому ступені; додаткова ж група стабілізує білкову частину й робить її менш уразливої до денатуруючим агентів. Таким чином, хоча безпосереднім виконавцем каталітичної функції є простетична група, що утворює каталітичний центр, її дія не можлива без участі поліпептидних фрагментів білкової частини ферменту. Більш того, в апоферменті є ділянка, що характеризується специфічною структурою, вибірково єднальний кофермент. Це так званий коферментзв’язуючий домен; його структура в різних апоферментів, що з'єднуються з тим самим коферментом, дуже подібна. Такі, наприклад, просторові структури нуклеотидзв’язуючих доменів ряду дегідрогеназ.

Активний й алостеричний центри.

По-іншому полягає справа в однокомпонентних ферментів, що не мають додаткової групи, що могла б входити в безпосередній контакт із сполукою, що перетворюється. Цю функцію виконує частина білкової молекули, що називається каталітичним центром. Припускають, що каталітичний центр однокомпонентного ферменту являє собою унікальне сполучення декількох амінокислотних залишків, що розташовуються в визначеній частині білкової молекули.

Найчастіше в каталітичних центрах однокомпонентних ферментів зустрічаються залишки Сер, Гіс, Три ,Арг, Цис, Асп, Глу й Тир. Радикали перерахованих амінокислот виконують тут ту ж функцію, що й кофермент у складі двокомпонентного ферменту.

Амінокислотні залишки, що утворюють каталітичний центр однокомпонентного ферменту, розташовані в різних точках єдиного поліпептидного ланцюга. Тому каталітичний центр виникає в той момент, коли білкова молекула набуває властиву їй третинну структуру. Отже, зміна третинної структури ферменту під впливом тих або інших чинників може призвести до деформації каталітичного центру і зміні ферментативної активності.

Крім каталітичного центра, утвореного сполученням амінокислотних радикалів або приєднанням коферменту, у ферментів розрізняють ще два центри: субстратний й алостеричний.

Під субстратним центром розуміють ділянку молекули ферменту, відповідальну за приєднання речовини (субстрату), що піддається ферментативному перетворенню. Часто цю ділянку називають 'якірною площадкою' ферменту, де, як судно на якір, стає субстрат. У багатьох випадках прикріплення субстрату до ферменту йде за рахунок взаємодії з ε -аміногрупою радикала лізину (Ліз), розташованого в субстратному центрі. Цю ж роль може виконувати СООН-група глутамінової кислоти (Глу), а також НS-група цистеїну (Цис). Проте роботи останніх років показали, що набагато більше значення тут мають сили гідрофобних взаємодій і водневі зв'язки, що виникають між радикалами амінокислотних залишків субстратного центру ферменту і відповідних угруповань у молекулі субстрату.

Поняття про каталітичний і субстратний центр не варто абсолютизувати. У реальних ферментах субстратний центр може збігатися (або перекриватися) із каталітичним центром. Більш того, каталітичний центр може остаточно формуватися в момент приєднання субстрату. Тому часто говорять про активний центр ферменту, що представляє собою сполучення першого і другого. Активний центр у ферментів розташовується на двох щілинах при двоядерній структурі, наприклад у лізоциму і рибонуклеази, або на дні глибокої западини, як у хімотрипсиногену.

Алостеричний центр являє собою ділянку молекули ферменту, у результаті приєднання до якої певної низькомолекулярної (а іноді - і високомолекулярної) речовини змінюється третинна структура білкової молекули. Внаслідок цього змінюється конфігурація активного центру, що супроводжується або збільшенням, або зниженням каталітичної активності ферменту. Це явище лежить в основі так званої алостеричної регуляції каталітичної активності ферментів.

Множинні форми ферментів.

Способи компонування протомерів у мультимери різноманітні. Вкрай важливо, що добудований із субодиниць фермент виявляє максимальну каталітичну активність саме у вигляді мультимеру: дисоціація на протомери різко знижує активність ферменту. Не усі ферменти-мультимери збудовані винятково з каталітично активних протомерів. Поряд із каталітичними в їхньому складі відзначені регуляторні субодиниці, як, наприклад, в аспартат-карбамілтрансферази.

Серед ферментів-мультимерів безумовно переважають димери і тетрамери (їх кілька сотень), у меншій мірі поширені гексамери й октамери (декілька десятків) і незвичайно рідко зустрічаються тримери і пентамери.

Молекули ферментів-мультимерів у ряді випадків складаються із субодиниць двох типів, що позначаються умовно як субодиниці типу А и В. Вони подібні одна з одною, але відрізняються по деяких деталях первинної і третинної структур. У залежності від співвідношення протомерів типу А и В у мультимері останній може існувати у вигляді декількох ізомерів, що називають ізозимами. Так, при чотирьох субодиницях можливі 5 ізозимів.

Зараз інтерес до ізозимів різко підвищився. Виявилося, що крім генетично детермінованих ізозимів існує велика група ферментів, що володіє множинними формами, що виникають у результаті їхній посттрансляційної модифікації. Множинні форми ферментів і ізозими зокрема використовуються зараз для діагностики хвороб у медицині, прогнозування продуктивності тварин, добору батьківських пар при скрещуванні для забезпечення максимального гетерозису в нащадку і т.п.

3. ЗАГАЛЬНІ УЯВЛЕННЯ ПРО КІНЕТИКУ І МЕХАНІЗМ ФЕРМЕНТАТИВНИХ ПРОЦЕСІВ. СПЕЦИФІЧНІСТЬ ДІЇ ФЕРМЕНТІВ. ВПЛИВ РІЗНИХ ФАКТОРІВ СЕРЕДОВИЩА НА ФЕРМЕНТАТИВНІ ПРОЦЕСИ (ТЕМПЕРАТУР, КОНЦЕНТРАЦІЇ ВОДНЕВИХ ІОНІВ І ІН.). АКТИВАТОРИ ТА ІНГІБІТОРИ. ЛОКАЛІЗАЦІЯ ФЕРМЕНТІВ У КЛІТИНІ.

Загальні уявлення про кінетику і механізм ферментативних процесів.

На першому етапі (I) відбувається активація ферменту шляхом зв'язування з алостеричним центром регуляторних речовин (наприклад, гормонів), що призводить до зміни конформації активного центру ферменту і збільшення його здатності зв'язувати молекулу субстрату.

На другому етапі (II) відбувається 'впізнавання' ферментом свого субстрату

На третьому етапі (III) відбувається формування неактивного фермент-субстратного комплексу за рахунок утворення гідрофобних і водневих зв'язків між радикалами амінокислотних залишків субстратного центру (контактні площадки) і відповідними групами в молекулі субстрату. Молекула субстрату утримується поблизу активного центру, але хімічним перетворенням ще не піддається.

На четвертому етапі (IV) утворюється активний фермент-субстратний комплекс. При цьому відбувається хімічне перетворення субстрату за участю каталітичного центру і коферменту (якщо мова йде про складний фермент). У результаті цього молекула субстрату змінює свою просторову конфігурацію, у ній відбувається перерозподіл енергії і зменшується міцність зв'язків.

На п'ятому етапі (V) фермент-субстратний комплекс стає нестабільним і потім перетворюється в комплекс фермент-продукт, що розпадається на продукти реакції і фермент. Фермент із реакції виходить у незмінному вигляді.

Специфічність дії ферментів.