Тема 2.5. Визначення масової частки білкових речовин. План
1. Визначення масової частки білкових речовин по методу К’єльдаля .
2. Модифікований метод К’єльдаля.
Питання, що винесене на самостійну роботу.
3. Визначення вмісту амінного азоту колориметричним та мідним методами. Перерахунок азоту на білок.
До складу ячменю входять азотисті речовини, в основному у вигляді білків. Їх кількість складає 9-12 % мас. від вмісту сухих речовин. Чим більше в ячмені вмісту білків, тим менше вуглеводів.
Білки відіграють велику роль в процесі виробництва пива. Продукти гідролізу білків – пептиди і поліпептиди – являються поверхньо-активними речовинами і обумовлюють піностійкіість пива і повноту його смаку.
Амінокислоти необхідні для живлення дріжджів, а також приймають участь в утворенні ароматичних і забарвлюючих речовин в процесі приготування солоду і пива, у формуванні смакового букету при його дозріванні.
Високомолекулярні білки здібні коагулювати при кип’ятінні і випадати в осад, а також можуть бути причиною помутніння пива і зниження його стійкості. Тому кількісне визначення білків і продуктів їх гідролізу має велике значення в техно-хімічному контролі пивоварного виробництва.
Кількість білкових речовин ячменю визначають по вмісту загального азоту. При цьому допускають, що весь азот міститься в білку.
Для визначення білків знаходять загальну кількість азоту в досліджуваних продуктах і перемножають його на перевідний коефіцієнт, який залежить від наявності азоту в даному білку. При вмісті азоту в білках в середньому 16 % перевідний коефіцієнт дорівнює 6,25 (100\16). Вказаний спосіб розрахунку білка по кількості азоту дає уявлення про вміст в продуктах не чистого білка, а так званого «сирого протеїну», так як разом з азотом білка одночасно визначають і азот пептидів, амінокислот, амідів і інших з’єднань.
Найбільш розповсюдженим методом визначення вмісту азоту являється метод К’єльдаля.
Суть його полягає в тому, що досліджуваний матеріал піддають окисленню концентрованою сірчаною кислотою при нагріванні. Сірчана кислота розпадається до сірчистого газу і окисляє вуглець досліджуваного матеріалу до вуглекислого газу, водень – до води, а азот відновлює в аміак.
RCHNH2COOH + H2SO4 --- SO2 + CO2 + H2O + NH3
Аміак, який утворився зв’язується з надлишком сірчаної кислоти в сірчанокислий амоній
2NH3 + H2SO4 = (NH4)2SO4
Потім сірчанокислий амоній розкладають розчином лугу
(NH4)2SO4 + 2NaOH = 2NH3 + Na2SO4 + 2H2O
Аміак, який виділився кількісно визначають титруванням розчином кислоти. По кількості аміаку визначають вміст білку. Для цього аміак, який виділився відганяють з водяними парами і вловлюють розчином сірчаної кислоти концентрацією 0,1 моль/дм3. Надлишок сірчаної кислоти, який не прореагувала з аміаком відтитровують розчином NaOH концентрацією 0,1 моль/дм3. По різниці між точним об’ємом кислоти в приймальній колбі і об’ємом лугу, який пішов на титрування надлишку кислоти, знаходять кількість кислоти, яка зв’язана з аміаком. 1см3 розчину сірчаної кислоти концентрацією 0,1 моль/дм3 вступає у взаємодію з аміаком в кількості, яка відповідає 0,0014 г азоту.
Хід роботи. Наважку досліджуваного матеріалу поміщають в колбу К’єльдаля. В цю ж колбу доливають 10 см3 х.ч. сірчаної кислоти (d=1,835). Вносять так, щоб частинки зерна не залишилися на стінці, а якщо це трапилося, то залишки змивають кислотою, в протилежному випадку вони не будуть спалені. В колбу додають сірчанокислий калій ( 1-1,5 г на 10 см3 кислоти, підвищує температуру кипіння, що також прискорює спалювання) і окису міді (як каталізатор, який прискорює реакцію окислення органічних речовин).
Отриману суміш обережно нагрівають у витяжній шафі на слабкому огні до тих пір, доки не стане пінитися (виділення газо утворюючих продуктів реакції), але слідкують, щоб не було викидів. Кипіння підсилюють так, щоб сірчана кислота безперервно кипіла. При кипінні повинна вилучатисяя не сірчана кислота, а продукти спалювання – H2O, CO2, SO2.
Спалювання наважки ведуть до повного освітлення розчину в колбі. Якщо на стінках колби осіли обвуглені частинки, то їх потрібно змити гарячою сумішшю, обережно повертаючи колбу. Освітлену рідину піддають додатковому нагріванню на протязі 1-2 год. Після повного спалювання колбу К’єльдаля охолоджують і добавляють в неї трохи води. Отриману рідину кількісно переносять в перегонну колбу місткістю 500 см3. Колбу К’єльдаля 3-4 рази ополіскують водою в кількості біля 200 см3, яку також виливають в перегонну колбу. Потім збирають прилад для перегонки. В приймальну колбу наливають 25см3 розчину сірчаної кислоти концентрацією 0,1 моль/дм3. В перегонну колбу добавляють скляні буси або кусочки пемзи, щоб не було поштовхів при кипінні, кидають лакмусовий папір і приливають 30-35%-ний розчин гідроксиду натрію до отримання лужної реакції (папір синіє). Щоб не було втрат аміаку колбу швиденько з’єднують з приладом і починають нагрівання.
Аміак і водяні пари, які конденсуються в холодильнику поступають в приймальну колбу з сірчаною кислотою, яка зв’язує аміак в сірчанокислий амоній. Перегонка проводиться 45-60 хв. Кінець перегонки визначають по реакції дистиляту: якщо капля не дає посиніння красного лакмусового паперу, то перегонку припиняють. По закінченню перегонки відвідну трубку ополіскують великою кількістю води, виймають відвідну трубку з колби, додають в колбу 3-5 капель метиленового синього і титрують розчином NaOH концентрацією 0,1 моль/дм3 до зміни забарвлення.
Вміст азоту N в % обчислюють за формулою:
де 0,0014 – кількість азоту, яка відповідає 1 см3 розчину сірчаної кислоти концентрацією 0,1 моль/дм3, г;
а – кількість розчину сірчаної кислоти концентрацією 0,1 моль/дм3 в прийомній колбі;
б – кількість розчину NaOH концентрацією 0,1 моль/дм3, що пішла на титрування надлишку розчину сірчаної кислоти, см3;
в- наважка , г.
Для перерахунку на білкові речовини кількість азоту множать на коефіцієнт 6,25.
Визначення загального азоту по модифікованому методі К’єльдаля.
Зміни в методі К’єльдаля полягає в тому, що при перегонці аміаку в приймальну колбу беруть не розчин сірчаної кислоти 0,1 моль/дм3, а 2%-ний розчин борної кислоти і амонійна сіль, яка утворилася при її взаємодії прямо відтитровують розчином сірчаної кислоти концентрацією 0,1 моль/дм3.
Хімічна реакція аміаку з борною кислотою протікає наступним чином. Спочатку борна кислота перетворюється в мета борну кислоту:
H3BO3 --- HBO2 + H2O,
яка реагує з аміаком
NH3 + HBO2 = NH4 + BO2-
Отриманий в результаті реакції аніон BO2 являється сильною основою і його можна титрувати сильною кислотою, при цьому проходить відновлення протона в борат аніон (основа): H++BO2- = HBO2. Сама борна кислота дуже слабо дисоціює і не вказує вплив на концентрацію іонів водню в середовищі.
Хід роботи. Спалювання наважки досліджуваного матеріалу проводять так само, як в методі К’єльдаля, але в приймальну колбу беруть 25 см3 2%-ної борної кислоти і 3-4 краплі індикатора. При відгонці аміаку розчин борної кислоти змінюється від малинового до зеленого. Перегонку закінчують через 20-30 хв. і вміст колби титрують розчином сірчаної кислоти концентрацією 0, 1 моль/дм 3 до переходу зеленого забарвлення в малинове.
Визначення білкових речовин колориметричним методом Лоурі.
Ці методи відрізняються швидкістю визначення , вони дуже зручні при масових аналізах і для визначення малої кількості білку в розчині.
Оснований на реакції реактиву Фоліна з фенольними радикалами, що входять до складу білків, при цьому утворювати забарвлені сполуки синього кольору різної інтенсивності забарвлення. Інтенсивність забарвлення залежить від вмісту білку.
За допомогою фотоелектроколориметра визначають оптичну густину, а потім по спеціальним графікам знаходять вміст азоту.
Мідний метод визначення білкових речовин.
Цей метод заснований на здатності амінокислот утворювати комплексні розчинні сполуки з надлишком ортофосфата міді. Надлишок ортофосфата міді відфільтровують і в прозорому фільтраті після додавання оцтової кислоти і калій йодистого . Надлишок йоду відтитровують розчином тіосульфату натрію . Потім визначають вміст міді по кількості тіосульфату натрію, що пішов на титрування, де 1 см3 розчину тіосульфату міді відповідає 0,28 мг азоту.
Література: [1, с. 69-73] ; [2, с.85-90], [3, с.62-70].