- •IV. Химический состав организмов
- •I. Особенности строения и свойств белков
- •II. Элементарный состав белков
- •Элементарный состав белков
- •VI. Оценка гомогенности белка
- •VIII. Оценка формы белковых молекул
- •IX. Аминокислотный состав белков
- •X. Пептиды. Методы их синтеза и биологическая активность (на самостоятельное изучение)
- •XI. Структура белковой молекулы
- •Четвертичная структура белка
- •XIII. Свойства белков
- •XIV. Номенклатура и классификация белков
- •XV. Функции белков в организме (на самостоятельное изучение; стр. 84, 85 в «Основах биохимии» ю.Б. Филипповича).
I. Особенности строения и свойств белков
Практически все известные проявления жизни, известные нашей цивилизации, напрямую или косвенно связаны с такими специфическими органическими веществами как белки.
Белки или протеины (от греч. слова «протос» – главный) обладают рядом выдающихся свойств, к которым относятся:
1) бесконечное разнообразие структуры и вместе с тем её высокая видовая специфичность;
2) возможность подвергаться многочисленным химическим и физическим превращениям;
3) способность к внутримолекулярным взаимодействиям;
4) способность отвечать на внешние воздействия закономерным изменением структуры и восстанавливать исходную структуру после прекращения воздействия;
5) склонность к взаимодействию с другими химическими соединениями с образованием надмолекулярных комплексов и структур;
6) наличие биокаталитических свойств.
II. Элементарный состав белков
Белки – это высокомолекулярные органические вещества, характеризующиеся достаточно строгим элементным составом.
Таблица
Элементарный состав белков
Химический элемент |
Его массовая доля в белках, % |
C |
50–55 |
H |
6,5–7,3 |
N |
15–18 |
O |
21–24 |
S |
0–2,4 |
зола |
0–0,5 |
Важная характеристика белков – процентное содержание азота, равное у большинства белков 16%. Оно служит отправной точкой для определения содержания белка в том или ином продукте питания или корме для животных, для чего найденное опытным путем в субстрате содержание белкового азота умножают на фактор пересчета, равный 6,25 (выводится делением 100 % на 16%).
III. Методы выделения белков из биологического материала
Для получения в чистом виде белки обычно выделяют из природных объектов. Только очень узкий перечень белков синтезирован искусственным путем (инсулин, рибонуклеаза, лизоцим, цитохромы и некоторые гормоны). Однако синтез белков – чрезвычайно длительная, трудоемкая и дорогостоящая процедура. Поэтому применяется очень ограниченно.
Все операции по выделению белка проводятся при низких температурах (от 0 до 50С) с использованием растворов с низкой концентрации и химических реактивов «мягкого» действия.
Основным критерием успеха при выделении белков, его первым этапом, является тщательное измельчение биологического материала вплоть до разрушения клеток, поскольку основная масса функционирующих белков содержится именно в клетках.
При этом используются специальные механические приспособления, а иногда – физические процессы.
Механические приспособления:
1) валковые мельницы (валки с трущимися металлическими поверхностями перетирают и раздавливают подаваемый сверху материал);
2) шаровые мельницы (металлическая емкость со стальными шариками, в которую помещается биологический материал, вращается, измельчая его);
3) ручные и механические гомогенизаторы (построены по типу ступок с пестиками или электрических мясорубок);
4) приборы для продавливания через фильеры (биологический материал специальным прессом продавливается через перегородку с тончайшими отверстиями).
Физические процессы:
1) метод попеременного замораживания и оттаивания (при замораживании происходит разрушение клеточных стенок и освобождение клеточного содержимого);
2) метод «азотной бомбы» (насыщение биологического материала азотом под давлением, затем резкое уменьшение давления);
3) метод разрушения ультразвуком (может повредить и сами молекулы белков; используется редко).
Второй этап выделения белков – их извлечение из разрушенного биологического материала переводом в растворимое состояние.
Извлечение белков осложняется тем, что помимо белков измельченная биомасса всегда содержит целый комплекс других веществ (липиды, углеводы, различные метаболиты и др.). От них необходимо обязательно избавиться. Для этого биологический материал обрабатывают солевыми растворами с концентрацией 8–10%. Процесс проводят путем выдерживания измельченной биологической массы в данном растворе в течение нескольких часов или даже нескольких суток при постоянном перемешивании.
Эффективность растворяющего действия солей отдельно по катионам и анионам в порядке убывания выглядит следующим образом:
Li+ > K+ > Na+
P2O74– > B4O72– > PO43– > CNS– > HCO3– > I– > Cl–
Поскольку белки представляют собой заряженные биополимеры с определенным соотношением отрицательных и положительных зарядов, их растворимость различна в растворах с разными значениями рН. Для извлечения нужных белков используют специальные буферные водно-солевые смеси.
Также для извлечения используют водно-спиртовые, спирто-солевые смеси и глицерин. Более поздними методами извлечения является обработка биологического материала растворами детергентов (додецилсульфата натрия, дезоксихолата натрия и т.д.).
IV. Разделение белков
Разделение белков является необходимым этапом их выделения в свободном, возможно кристаллическом состоянии. Существует несколько основных методик разделения белков:
1) Фракционирование белков солевыми растворами или фракционное высаливание. Метод основан на различной растворимости белков в растворах солей с определенной концентрацией. Варьируя концентрацию солевых растворов от минимальной до максимальной, можно один за другим выделить относительно чистые индивидуальные белки или, в крайнем случае, довольно узкие фракции белков. Для определения границ концентраций соли, в которых происходит осаждение определенных белков, строят разностные диаграммы.
В некоторых случаях применяют осаждение спиртами, спирто-солевыми смесями или солями тяжелых металлов.
2) Метод электрофореза. Поскольку молекулы белков чаще всего обладают суммарным положительным или отрицательным зарядом, для их разделения целесообразно использовать постоянный электрический ток (малой силы, но большого напряжения), пропускаемый через белковый раствор. При этом положительно заряженные белковые молекулы движутся к катоду, а отрицательные – к аноду. Разделение белков более эффективно не в растворах, а в тонких слоях сорбентов полимерного строения (силикагеля, целлюлозы, ацетилцеллюлозы, геля агар-агара, крахмальном и полиакриламидном гелях). Этот метод называется электрофорезом в поддерживающих средах. Особый эффект достигается в гелях полимеров, имеющих трёхмерное строение, и обладающих регулируемым размером пространственных ячеек, по которым движутся молекулы белка (гель сополимера акриламида и метиленбисакриламида).
При электрофорезе белковых растворов необходимо поддерживать некоторые параметры в определенных границах: ионную силу раствора, рН, состав буферных смесей, а также величины приложенных потенциалов.
Описанные методы наиболее эффективны для фракционного разделения белков, однако недостаточно эффективны для их индивидуализации.
Для получения индивидуальных белков чаще всего используются хроматографический метод и метод молекулярных сит.
3) Хроматографический метод разделения белковых фракций заключается в пропускании белковой смеси, подлежащей разделению, через хроматографическую колонку, заполненную адсорбентом (метод колоночной хроматографии, основанный Цветтом в 1903 г.). В качестве адсорбента используются разнообразные неорганические и органические вещества: гель фосфата кальция, силикагель, производные целлюлозы, декстран и т.д. Помимо разделяемой белковой смеси используют элюент – обычно раствор нескольких солей в воде или смесь жидких органических веществ, который добавляют в хроматографическую колонку после белкового раствора. Элюент способствует прохождению белкового раствора через колонку и вымывает его с адсорбента. Из колонки выходят порции элюента, содержащие чистый белок.
Химики иногда применяют в качестве адсорбента вещества, избирательно связывающие определенные белки, что приводит к резкому повышению эффективности хроматографии. Такой способ называется афинной хроматографией или хроматографией сродства.
4) Метод молекулярных сит – разновидность хроматографии, в которой роль адсорбента играет сефадекс (обработанный эпихлоргидрином полисахарид декстран), имеющий сетчатую трёхмерную структуру с поперечными связями между полимерными цепочками. Размеры ячеек сетчатой структуры можно варьировать. Гранулы сефадекса, помещенные в хроматографическую колонку, достаточно легко пропускают крупные молекулы белка, а маленькие молекулы остаются в нишах трёхмерной сетки. Поскольку гранулы сефадекса склонны к сильному разбуханию с образованием геля, этот метод также называют методом гельфильтрации.
V. Очистка белков
Индивидуальные белки, полученные в результате разделения белковых смесей, обычно содержат множество низкомолекулярных примесей. Очистка белков от них может осуществляться диализом, электродиализом, ультрафильтрацией, кристаллизацией, перекристаллизацией и др. способами.
1) Диализ раствора белка проводят в специальном приборе – диализаторе, рабочая часть которого состоит из коллодиевого диализационного мешочка, омываемого дистиллированной водой. Диализационный мешочек всегда снабжают капиллярной трубкой, поскольку во время диализа происходит увеличение объема белкового раствора. Диализ в диализаторе проводят в течение нескольких часов или нескольких суток. Через мелкие поры в коллодиевом или целлофановом мешочке из белкового раствора выходят низкомолекулярные примеси, тогда как крупные молекулы белка остаются на месте.
Более эффективным способом очистки белка является электродиализ. Причем, применяется он чаще всего не как индивидуальный способ очистки, а как дополнение к обычному диализу.
2) Электродиализ. Прибор для проведения электродиализа более сложен. Для него используется не обычный диализационный мешочек, а сосуд, боковые стенки которого выполнены из полупроницаемых мембран. Параллельно боковым стенкам сосуда для электродиализа помещают электроды, на которые подают постоянный электрический ток. В результате этого остатки ионов, содержащихся в белковом растворе, прошедшем предварительный диализ, устремляются к соответствующим электродам (в зависимости от своего заряда), и белковый раствор окончательно очищается.
Высокопрочные полупроницаемые мембраны также используются и в другом способе очистки белков – ультрафильтрации.
3) Ультрафильтрация – способ очистки белков, использующий продавливание белкового раствора через высокопрочную полупроницаемую мембрану с помощью сжатого газа или центробежной силы. При этом вода и низкомолекулярные соединения проходят через мембрану, а белок остается на мембране в виде концентрированного раствора.
4) Очистка кристаллизацией проводится из солевых белковых растворов медленным испарением воды до точки высаливания белка. Первые два белка, полученных в кристаллическом состояния, были оксидаза (1906 г, А.Д. Розенфельд) и уреаза (1926 г., Д. Самнер).
Кристаллизация является также мерой чистоты белка, поскольку только очень чистый индивидуальный белок способен к кристаллизации.