Методика.

Данная работа производилась на изолированном препарате левой половины диафрагмы мыши и подходящего к ней диафрагмального нерва с использованием метода регистрации мембранного потенциала микроэлектродной техникой. Для регистрации мин ПКП использовались хлорсеребряные электроды диаметром 0,4-0,6 мм . Отводящий электрод погружался в экспериментальную камеру, заполненную физиологическим раствором Лайли, что соответствовало внеклеточной среде. Регистрирующий электрод вставлялся в шахту стеклянного микроэлектрода, наполненного 2,5 М KCL и с помощью микроманипулятора подводился к мембране и погружался внутрь клетки. Заземление осуществлялось через отводящий электрод. Вся установка, включающая в себя микроманипулятор, микроскоп и эксперементальная камера были расположены внутри камеры Фарадея. Усилители с блоками питания были расположены вне камеры. Запись сигналов осуществлялась в программе PowerGraph Professional.

Состав физиологического раствора Лайли:

NaCl – 135 mM

KCl – 4 mM

NaH2PO4 – 0.9 mM

MgCl2 – 1 mM

CaCl2 – 2 mM

NaHCO3 – 16.3 mM

Глюкоза – 11 mM.

Используемый в эксперименте раствор был изготовлен непосредственно перед началом эксперимента.

Изолированный препарат фиксировался в камере на специальной подложке энтомологическими булавками с растяжением мышцы до ее нормальных размеров. Мышца была погружена в раствор Лайли на протяжении всего эксперимента со сменой раствора каждые 10-15 минут. В ходе работы было использовано 6 препаратов.

Ход работы.

Препарат, зафиксированный в камере помещался в экспериментальную установку на предметный столик микроскопа. Под микросокопом производилось отыскание синаптических зон, куда вводился микроэлектрод для регистрации миниатюрных ПКП. Вхождению микроэлектрода внутрь клетки соответствовало изменение измеряемого мембранного потенциала с Vm=0 до Vm= 50-70 mV. При попадании в синаптическую область регистрировались миниатюрные ПКП с амплитудой ~1mV и частотой ~1Нz. Запись производилась из расчета ~100 мин ПКП/файл записи, соответствующий работе одного синапса. После записи 5-7 разных синапсов, работающих в физиологическом растворе Лайли (контроль), производилась смена раствора Лайли на раствор оуабаина С=10 нМ и осуществлялась запись в течение 1,5-2 ч. после смены раствора на оуабаин.(запись производилась в том же режиме, что и запись контроля.)

Полученные файлы были подвергнуты предпроцессингу в программе mini Analysis, после чего была посчитана статистика в рамках программ Microsoft Office Exel и Statistica 10.

Результаты и обсуждение.

Рис 1. Распределение амплитуды миниатюрных ПКП для контрольной (n=1653) и опытной (n=1515) групп.

На рисунке 1 показано распределение амплитуд зарегистрированых мин. ПКП для двух групп – контрольной и опытной. Распределение в обоих случаях соответствует нормальному (критерий Шапира-Уилка). Это объясняется тем, что порция одного кванта, соответсвующая одному мин ПКП постоянна для каждой группы, то есть содержит примерно одинаковое количество ацетилхолина. При этом из рисунка видно, что в опытной группе (оуабаин) средняя амплитуда выше чем в контрольной, что может свидетельствовать об эффекте оуабаина. Для проверки этой гипотезы было выполнено сравнение средних амплитуд мин. ПКП для обоих групп с применением Т-критерия (рис.2)

Рис.2. Сравнение средней амплитуды мин. ПКП для контрольной и опытной групп.

# p=0.01, T-критерий (Стьюдента)

Из рис 2. видно, что под воздействием оуабаина амплитуда мин. ПКП значимо возрастает, что может быть обусловлено как воздействием оуабаина на пресинаптическом уровне, так и воздействием на постсинаптическую мембрану. Известно, что оуабаин в низких концентрациях воздействует на рианодиновые рецепторы, активируя их, что приводит к увеличению внутриклеточной концентрации ионов кальция. При этом сам, по себе являясь ингибитором Na/K АТФазы, должен приводить к деполяризации постсинаптической мембраны, что привело бы к уменьшению амплитуды мин. ПКП. Однако, по литературным данным известно, что наномолярные концентрации оубаина, (в частности 10 нМ, используемая в эксперименте) скорее активируют рианодиновые рецепторы, чем ингибируют Na/K насос. Чтобы учесть возможный вклад постсинаптической мембраны в данном феномене, было произведено сравнение мембранного потенциала для контрольной и опытной групп (рис.3).

Рис. 3. Сравнение мембранного потенциала в контрольной и опытных группах.

p=0.07 , T-критерий для зависимых выборок.

Из рисунка 3 видно, что различия значений мембранного потенциала между контрольной и опытной группой статистически не достоверны, однако можно говорить о тенденции постсинаптической мембраны к гиперполяризации при воздействии оуабаина, которая может быть обусловлена калиевым током через кальций-зависимые калиевые каналы, участвующие в норме при следовой гиперполяризации потенциала действия. В свою очередь повышение внутриклеточной концентрации кальция опосредовано воздействием оуабаина на рианодиновые рецепторы мышечного волокна. Однако такая тенденция может лишь говорить о вкладе в увеличение амплитуды мин. ПКП на постсинаптическом уровне, но не полностью обьяснять эффект вещества. Исходя из этого, необходимо учитывать и вклад нервной терминали в увеличение амплитуды мин. ПКП. Логично предположить воздействие оуабаина на рианодиновые рецепторы нервной терминали с последующей их активацией. Увеличение амплитуды мин. ПКП свидетельствует о несколько большем количестве медиатора, освобождаемого из синапса. Таким образом можно предположить о воздействии кальция на везикулярный ацетилхолиновый транспортер, что приводит к большей закачке молекул медиатора в везикулы и соответственно, к большему количеству медиатора, высвобождаемого в синаптическую щель. Из вышесказанного следует, что при воздействии оуабаином увеличение амплитуды мин. ПКП может быть обусловлено как на пресинаптическом, так и на постсинаптическом уровнях.

Рис. 4. Сравнение средней амплитуды мин. ПКП. Опытная группа разбита на 2 подгруппы в зависимости от времени воздействия оуабаина.

При разбитии опытной группы на подгруппы, статистика различий не выявила, что скорее всего связано с недостаточностью обьема выборки. Однако из рис. 4 видно, что основное увеличение амплитуды наблюдается спустя час после подачи вещества. Это время характеризует прохождение вещества из раствора, омывающего ткань через мембрану к рианодиновым рецепторам.

Рис 5. – Сравнение частоты мин. ПКП между контрольной и опытной группами.

# P<0.05 , тест Вилкоксона.

При сравнении частоты мин ПКП, для контрольной и опытной групп, статистических различий выявлено не было. Так же производилось сравнение между группами для таких параметров как время подьема и время полуспада. Не было выявлено различий ни по одному из этих параметров (см. дополнение).