МГУ им. М.В. Ломоносова, Биологический Факультет.

Кафедра физиологии человека и животных.

Большой практикум по электрофизиологии возбудимых систем.

Исследование постсинаптических потенциалов на примере миниатюрных потенциалов концевой пластинки диафрагмы мыши.

Выполнил:

Яковлев Лев

-MOSKAU-

-2014-

Оглавление

Введение. 3

Методика. 4

Ход работы. 5

Результаты и обсуждение. 6

Дополнение. 11

Выводы 12

Введение.

Одним из способов передачи сигнала между клетками является передача возбуждения посредством химического синапса – высокоспециализированного функционального контакта между нейроном и другими клетками, где в качестве посредника передачи сигнала выступает химическое вещество – медиатор (нейромедиатор). Наиболее удобными для изучения являются синапсы, образованные мотонейронами на скелетных мышечных волокнах, получившие название концевых пластинок. Удобство использовать концевые пластинки позвоночных, как модель химических синапсов обусловлено в первую очередь, относительно крупными размерами: места окончания двигательных нервов на мышечных волокнах различимы под лупой или бинокуляром. Вследствие этого, концевая пластинка является наиболее изученным типом синапса.

Посредником нервно-мышечной передачи в концевой пластинке является медиатор ацетилхолин, синтезирующийся в цитоплазме аксона и собирающиеся в пресинаптическом окончании двигательного нейрона в специальных синаптических пузырьках – везикулах, формируя так называемую, активную зону – выпячивание пресинаптической мембраны, вокруг которой сконцентрированы везикулы, представляющие собой мембранные пузырьки, заполненные медиатором. Постсинаптическая мембрана образует складки, соответственно под активными зонами. Медиатор, освобождается путем экзоцитоза в синаптическую щель, откуда вещество проникает к постсинаптической мембране для взаимодействия с рецепторами. Везикулы способствуют порционному освобождению медиатора, причем показано, что порции, соответсвующие сожержимому одной везикулы примерно одинаковы и содержат несколько тысяч молекул медиатора (в частности, для ацетилхолина концевых пластинок, это число приблизительно равно 10000). Порция, соответствующая содержимому одной везикулы называется квантом медиатора, таким образом, сигнал, передающийся от нейрона клетке нельзя считать непрерывным – он квантован, и природа далее описанных потенциалов так же является квантовой. Действие медиатора в синаптической щели ограничено. В общем, вещество может либо деградировать, либо подвергаться обратному захвату в нейрон. Для ацетилхолина характерна деградация до холина и уксусной кислоты под действием фермента АЦетилХолинэстеразы, распологаюшегося в синаптической щели.

Молекулярный механизм освобождения везикул заключается во взаимодействии внутриклеточного кальция с белками, связывающими везикулы с мембраной терминали. Повышение внутриклеточного кальция потенциалзависимо – т.е. осуществляется через потенциал-зависимые кальциевые каналы в ответ на деполяризацию вызванную, как правило потенциалом действия.

Электрофизиологическим проявлением квантовой природы выброса медиатора являются особые потенциалы, регистрируемые на постсинаптической мембране при внутриклеточном отведении в состоянии покоя. Эти потенциалы были впервые зарегестрированы в 1952 г. П. Фэттом и Б. Катцем и получили название миниатюрных потенциалов концевой пластинки (мин. ПКП). Миниатюрные потенциалы возникают с частотой ~1Гц и амплитудой 0,1 – 1 мВ без внешних воздействий на нервное волокно. Это свидетельствует о спонтанном освобождении медиатора в отсутствии нервного сигнала.

Частота мин. ПКП соответствует числу квантов, освобождаемых в единицу времени синапсом – свидетельствует о состоянии пресинаптической терминали и не зависит от состояния постсинаптической мембраны.

Амплитуда зависит от нескольких факторов, включая мембранный потенциал мышеченого волокна, сопротивление его мембраны а так же активность АЦХэстеразы.

Фаза нарастания мин ПКП соответствует времени, в течение которого входящий синаптический ток течет через холинорецепторы (сопротивление холинорецепторов для входящего тока) и емкость Сm постсинаптической мембраны. Фаза же спада соответствует разрядке емкости мембраны через ее пассивное сопротивление Rm – является функцией постоянной времени мембраны. Постоянная времени = Rm*Cm.

Оуабаин относится к классу сердечных гликозидов, основных веществ, блокирующих Na/K АТФазу, это обусловлено наличием рецепторной последовательности к сердечным гликозидам в цепи альфа-субьединицы молекулы. В свою очередь Na/K АТФаза является интегральным белком мембраны, задачей которого является поддержание трансмембранного градиента Na и K, мембранного потенциала и возбудимости клеток. Соответственно при ингибировании этого белка наблюдается прекращение активного траспорта Na и К, помимо этого, вследствие электрогенности насоса, потенциал покоя смещается в более положительную область. Этим обусловлен первичный эффект вещества. Помимо этого, известно, что воздействие оуабаина так же приводит к повышению цитоплазматического кальция, что может быть опосредовано воздействием на рианодиновые рецепторы, а так же увеличению внутриклеточной Ca2+ концентрации засчет уменьшения его экскреции из клетки, связанную с нарушением Na/Ca обмена (вследствие повышения внутриклеточной концертации Na). Таким образом реализуется так-называемый положительный инотропный эффект сердечных гликозидов, достигаемый при введении низких концентраций веществ. В частности показано, что дигоксин (сердечный гликозид), проникая через мембрану в наномолярных концентрациях активирует рианодиновые рецепторы, что приводит к увеличению внутриклеточной концентрации кальция и соответственно – к увеличению сокращений сердечной мышцы овцы, скелетной мышцы лягушки. Так же в опытах по воздействию оуабаина на диафрагму крысы что в диапазоне концентраций 10-100 нМ наблюдался выраженный положительный инотропный эффект, выраженный в увеличении силы сокращений, однако при воздействии концентрацией = 1мкМ наблюдалась лишь тенденция к увеличению, что обусловлено токсическим действием вещества в данной концентрации.