7. Практичні завдання

Приготувати препарати «роздавлена крапля» і «висяча крапля» культур Lactobacillus acidophilus , Bacillus megaterium , Saccharomyces cerevisiae.

1. Приготувати предметні і покривні скла для мікроскопії. Вони повинні бути чистими і добре знежиреними, щоб нанесена на них крапля рівномірно розтікалася. Досягається це кількома способами. Скла можна прокип'ятити 15 хв. в 1 % -му розчині соди або в мильній воді, сполоснути водопровідною водою, помістити на 5-10 хв. в слабку хлористоводневу кислоту і добре промити дистильованою водою. Можна також готувати скла до роботи, витримавши їх попередньо по 2 год. в концентрованої сірчаної кислоти або хромової суміші. Після цього промити їх у проточній воді, прокіп'ятіть в 2 % розчині лугу протягом 10 хв., ретельно промити проточною, а потім дистильованою водою. Знежирені предметні скла можна приготувати, використовуючи для цієї мети шматочок мила, яким необхідно натерти робочу поверхню скла, а потім ретельно витерти її сухою серветкою. Чисті скла помістити ка зберігання в судини з притертими пробками в суміші рівних обсягів спирту та ефіру або в 96 % -й спирті.

Рис . 3. Схема приготування препарату « роздавлена крапля » : а - вид зверху : б - вид збоку; І - предметне скло; 2 - покривне скло.

2. Приготувати препарат «роздавлена крапля».

а) На чисте і знежирене предметне скло бактеріологічною петлею покласти досліджувану культуру. Якщо мікроорганізми знаходилися в суспензії (у рідкому живильному середовищі ), їх наносять безпосередньо па предметне скло. Якщо ж матеріал взято з щільного поживного середовища, тоді його внести до нанесеної попередньо на предметне скло краплю стерильної водопровідної води, стерильного фізіологічного розчину або бульйону. Можна також з культури, вирощеної на щільному живильному середовищі, попередньо приготувати суспензію мікроорганізмів. Для цього в пробірку з мікроорганізмами, що виросли на скошеній агаровій поверхні, внести 4-5 мл стерильного фізіологічного розчину або водопровідної води і, обертаючи пробирку між долонями, змити мікробні клітини з поверхні середовища.

б) На предметне скло на край краплі опустити ребром під кутом 45° покривне скло і, обережно нахиляючи, покласть його на краплю так, щоб у ній не утворилися бульбашки повітря (рис. 3). Краплю потрібно брати такої величини , щоб вона заповнювала весь простір між покривним і предметним склом і не виступала за краї покривного скла. Якщо рідина буде нанесена в надлишку, її необхідно видалити за допомогою смужок фільтрувального паперу.

3. Для приготування препарату «висяча крапля» взяти скло зі шліфованої лункою. Краї лунки змастити вазеліновим маслом. На покривне скло стерильно в центр нанести краплю досліджуваного матеріалу (рис. 4). Потім предметне скло перевернути лункою вниз і помістити на покривне так, щоб крапля знаходилась в центрі лунки, не стикаючись з її краями. Предметне скло легенько притиснути до покривного і перевернути. В утвореній герметичній камері капля не висихає, що дозволяє спостерігати за мікроорганізмами тривалий час.

Приготувати для мікроскопічного дослідження фіксовані пофарбовані препарати Micrococcus lysodeikticus, Bacillus subtilis, Sarcina flava, Streptococcus lactis (albus).

Р ис . 4. Схема приготування препарату «висяча крапля»: 1 - IV - етапи приготування: 1 - предметне скло з лункою, 2 - крапля, 3 - покривне скло.

1. За допомогою стерильної бактеріологічної петлі або піпетки Пастера нанести на знежирене предметне скло краплю бактеріальної суспензії. Матеріал з щільних поживних середовищ взяти бактеріологічною петлею і внести його в краплю стерильної водопровідної води, попередньо нанесену на предметне скло. Мікробний матеріал рівномірно тонким шаром розтерти на площі 1,5 - 2 см ( рис. 5).

2. Висушити приготований мазок при кімнатній температурі.

3. Після висушування мазок зафіксувати в полум'ї пальника. Тримаючи скло мазком вгору, тричі провести його через полум'я пальника. Щоб уникнути перегріву мікроорганізмів час прямого впливу полум'я не повинно перевищувати 3-4 с.

4. Препарат помістити мазком вгору на місток з двох паралельних скляних паличок, з'єднаних гумовими трубками і знаходяться на стінках кювети або кристалізатора.

5. Піпеткою нанести на мазок 2-3 краплі водного розчину фуксину так, щоб фарба покрила весь мазок. Фарбувати протягом 2-3 хв.

6. Легким струменем води змити з препарату барвник. Змивати до тих пір, поки вода не стане безбарвною.

7. Препарат висушити на повітрі або легко промокнути фільтрувальним папером. Краї скла і тильну сторону добре протерти серветкою або фільтрувальним папером.

Дивитись приготовані препарати мікроорганізмів під мікроскопом, дотримуючись наступного порядку і правила роботи з мікроскопом.

 

Рис. 5. Послідовність приготування фіксованого пофарбованого мазка .

1. Попередньо провести настройку освітлення мікроскопа . З цією метою з тубуса вийняти окуляр і, спостерігаючи прямо в об'єктив, встановити дзеркало так, щоб джерело світла був у центрі об'єктива.

2. Після попереднього налаштування освітлення на предметний столик мікроскопа покласти препарат і закріпити його клемами. Приготовлені препарати «роздавлена крапля» і «висяча крапля» переглянути спочатку з об'єктивами 20х або 40х, а потім з імерсійним об'єктивом. Фіксовані пофарбовані препарати мікроскопіювати спочатку з об'єктивом 40х, потім - з об'єктивом 90х. У правильно пофарбованому і добре промитом препараті поле зору залишається світлим і чистим, а забарвленими виявляються клітини мікроорганізмів.

3. Дослідити препарат, користуючись сухим об'єктивом (40х), за допомогою макрометріческого гвинта опустити об'єктив до препарату, не допускаючи зіткнення його з покривним склом (або предметним). Після цього, дивлячись в окуляр, за допомогою макрометріческого гвинта повільно підняти об'єктив вгору до появи контурів об'єкта в полі зору мікроскопа. На цьому етапі за допомогою конденсора шляхом переміщення його вгору або вниз додатково відрегулювати інтенсивність освітлення. Потім обертанням мікрометричного гвинта домогтися найкращої чіткості зображення.

4. При переході від малого збільшення до великого об'єкт встановити строго по центру поля зору і тільки після цього за допомогою револьвера поміняти об'єктив, в цьому випадку препарат (об'єкт) залишається у фокусі, що полегшує подальше його дослідження.

5. При переході на іммерсійний об'єктив, після того як препарат встановлений в центрі поля зору, за допомогою макрометріческого гвинта підняти об'єктив на 2 см від предметного скла і нанести на мазок стеклянною паличкою краплю імерсійного масла. За допомогою револьвера встановити в робоче положення об'єктив і, обертаючи макрометріческій гвинт за годинниковою стрілкою занурити його в іммерсійну рідину, уникаючи при цьому дотику до поверхні предметного або покривного скла. Цей етап слід контролювати, дивлячись на об'єктив збоку. Потім, дивлячись в окуляр, за допомогою макрометріческого гвинта повільно піднімати об'єктив до появи в полі зору контурів зображення об'єкта або забарвленого плями. Після цього чіткість зображення коригувати за допомогою мікрометричного гвинта.

6. При зміні препарату або після закінчення микроскопирования тубус мікроскопа підняти, препарат зняти з предметного столика і, якщо дослідження проводилося з імерсійною системою, фронтальну лінзу об'єктива ретельно очистити від масла, протерши серветкою, змоченою бензином.

7. Відключити мікроскоп від енергопостачання та закрити чохлом.

8. Використані препарати покласти в посуд з дезінфікуючим розчином.

9. Прибрати робоче місце