Методи дослідження мікроорганізмів у светлопольному мікроскопі

Мікроскопічне дослідження мікроорганізмів проводять в живому або фіксованому пофарбованому станах. Мікроскопія мікробних клітин в живому стані застосовується головним чином для вивчення їх розмірів, форми, структури, рухливості, характеру розмноження, відносин клітин до різних хімічних подразників. З цією метою найбільш часто готують препарати «роздавлена крапля» і «висяча крапля». Мікроорганізми в цих препаратах можна піддавати прижиттєвому забарвленню. Так як більшість використовуваних в мікробіології барвників токсичні, для прижиттєвого фарбування мікроорганізмів їх використовують в дуже малих концентраціях від 0,001 до 0,0001 %. У препараті «висяча крапля» мікроорганізми можна спостерігати протягом тривалого часу - тиждень і більше.

Фіксований пофарбований препарат мікроорганізмів готують у кілька етапів; приготування мазка, висушування його, фіксація та фарбування. Мазки готують на чистих знежирених стеклах (предметних) з мікробних суспензій або з культур, вирощених на щільних поживних середовищах. Якщо необхідно вивчити природне розташування мікроорганізмів у колоніях, вирощених на поверхні щільного живильного середовища, то готують препарат - відбиток. Висушують мазки або препарати - відбитки при кімнатній температурі, так як висушування при високій температурі порушує форму мікробних клітин. На наступному етапі мазок фіксують. При цьому клітини міцно прикріплюються до поверхні скла, підвищується їх спорідненість до барвників і, нарешті, клітини гинуть, що важливо при роботі з патогенними мікроорганізмами. Самий простий і поширений спосіб фіксації - фіксація жаром придатний для спостереження морфології мікробних клітин, але не для вивчення їх будови, так як при дії високих температур структура клітин істотно змінюється. Крім спеки фіксацію можна проводити хімічними речовинами (рідинами і парами). Для цього використовують 96 % етиловий спирт (час фіксації 5-10 хв), суміш Нікіфорова, що складається з абсолютного етилового спирту і ефіру у відношенні 1: 1 (час фіксації 10-15 хв.), безводний метиловий спирт (час фіксації 3-5 хв.) , ацетон (час фіксації 5 хв.) та ін.

Фіксований препарат фарбують. Більшість фарб, застосовуваних у мікробіологічній практиці, являють собою сполуки, найчастіше похідні бензолу і його гомологів, які отримують або шляхом хімічного синтезу, або з кам'яновугільної смоли. Вони можуть бути основними, кислими і нейтральними. У лабораторних умовах можна швидко визначити, який характер (кислий чи основний) має водний розчин того чи іншого барвника. Для цього на фільтровальний папір наносять краплю досліджуваної фарби. Так як фільтрувальна папір заряджений негативно, то при основних властивостях фарби вода розтікається у вигляді безбарвної зони навколо фіксованої плями фарби, при кислих - фарба і вода розтікаються однаково. Основні фарби з'єднуються з речовинами клітини, мають кислі властивості , а кислі - з речовинами з основними властивостями. У практиці мікробіологічних досліджень частіше використовуються основні фарби. Це пояснюється тим, що більшість бактерій несуть на поверхні клітини негативний електричний заряд і в їх цитоплазмі переважають речовини з кислими властивостями. Виходячи з спорідненості клітинних речовин до основних, кислим або нейтральним фарбам, введені відповідно поняття базофилия , ацидофілія і нейтрофилия. Такий поділ, однак, є відносним, оскільки більшість клітинних речовин є амфотерними сполуками і залежно від значення pH середовища можуть набувати кислі, нейтральні або основні властивості.

У мікробіологічній практиці найбільш вживаними фарбами є: червоні - фуксин основний і фуксин кислий, нейтральний червоний, конго червоний , еозин К, еритрозин; сині - метиленовий блакитний, толуїдиновий блакитний: зелені - малахітовий зелений, діамантовий зелений, янус зелений; фіолетові - генціан фіолетовий, кристалічний фіолетовий, гематоксилін; коричневі - основний коричневий, хрізоідін; жовті - пікринова кислота, флуоресцеїн; чорні - індулін спірторастворнмий, нігрозин водорозчинний та ін.