Фазово-контрастна мікроскопія

Людське око виявляє лише різницю в довжині (кольорі) і амплітуді (інтенсивності, контрастності) світлової хвилі, але не вловлює відмінностей у фазі.

Майже всі живі клітини прозорі, так як світлові промені, що проходять через живу клітину, не міняють своєї амплітуди, хоча і змінюються по фазі.

Перетворити «фазовий» (неконтрастний) препарат у «амплітудний» (контрастний) можна, або фарбуючи об'єкт (для живих клітин цей прийом малопридатний), або знижуючи апертуру конденсора шляхом прикривання діафрагми (прийом також небажаний, так як знижується роздільна здатність мікроскопа).

Метод фазово-контрастної мікроскопії, запропонований голландським фізиком Церніке для спостереження за прозорими об'єктами, заснований на перетворенні фазових змін, зроблених світловою хвилею при проходженні через об'єкт, в видимі амплітудні, за допомогою спеціального оптичного пристрою. Якщо в об'єктив звичайного мікроскопа вмонтувати спеціальний диск - фазову пластинку з кільцем (виходить шляхом напилення диска солями рідкісних металів товщиною в кілька десятих мікрометра), а в конденсор - кільцеву діафрагму (непроникну для променів світла пластинку, в якій є прозора щілина у вигляді кільця), так щоб через конденсор і об'єктив проходило лише кільце світла, яке потім поєднується з кільцем фазової платівки об'єктива, то фази світлового променя зсуваються (зазвичай на одну чверту довжини хвилі) і можна спостерігати ефект фазового контрасту. Фазові зміни переходять у амплітудні, і препарат стає контрастним.

Для проведення досліджень необхідно на додаток до світлового мікроскопу мати фазово-контрастний пристрій (в даний час найбільш широко застосовується модель КФ-4), яке складається з фазових об'єктивів (на оправі є буква «Ф»), конденсорів з набором кільцевих діафрагм і допоміжного мікроскопа (оптичного пристрою, що розміщується в тубус замість окуляра при установці фазового контрасту).

Метод застосовують для дослідження живих клітин мікроорганізмів, контрастність яких досягається оптичним шляхом без втручання в фізіологічні процеси, що вивчаються.

Люмінесцентна (флуоресцентна) мікроскопія

У СРСР метод люмінесцентної мікроскопії розроблений М. Н. Мейселем. Суть методу полягає в тому, щодеякі біологічні об'єкти здатні при висвітленні короткохвильовими променями (синьо-фіолетовими, ультрафіолетовими) поглинати їх і випускати промені з більш довгою хвилею (світитися жовто-зеленим або помаранчевим світлом). Це так звана власна, або первинна, люмінесценція. Об'єкти, що не люмінесціюють, можна обробити спеціальними флуорохромами (акридином жовтим, акрідін помаранчевим, аураміном, прімуліном, тіофаліпіном, конго червоним, тетрацикліном, хініном) і також спостерігати люмінесценцію, але це вже буде наведена, або вторинна, люмінесценція, яка набагато частіше використовується в мікроскопії .

Препарати, забарвлені флуорохромами, вивчають у середовищах, що не люмінесцирують під дією коротко-хвильових променів, у воді, гліцерині, вазеліновому маслі або фізіологічному розчині.

Оптична схема люмінесцентного мікроскопа відрізняється від звичайної схеми вибором джерела світла (зазвичай ртутна лампа, але у випадку збудження люмінесценції об'єкта синьо-фіолетовими променями можна використовувати і низьковольтні лампи) і наявністю на шляху променів двох світлофільтрів: синій світлофільтр перед конденсором, що пропускає синьо-фіолетові промені видимого спектру, і жовтий світлофільтр в окулярі мікроскопа, що прибирає сині промені, що заважають виявленню люмінесценції.

Переваги люмінесцентної мікроскопії в порівнянні із звичайною полягають в наступному: поєднання кольорового зображення і контрастності об'єктів; можливість вивчення морфології живих і мертвих клітин мікроорганізмів у поживних середовищах і тканинах тварин і рослин; дослідження клітинних мікроструктур, вибірково поглинаючих різні флуорохроми, які є при цьому як би специфічними цитохімічними індикаторами; вивчення функціонально-морфологічних змін клітин; використання флуорохромов при імунологічних реакціях і підрахунку бактерій в зразках з невисоким їх змістом.