26.7. Хроматография

Хроматография является эффективным методом разделения и анализа биологических систем и объектов окружающей среды, позволяющим разделять смесь практически любых веществ. Ос­новоположником хроматографического метода и самого термина "хроматография" (от греч. chroma - цвет, grapho - пишу) явля­ется русский ботаник М. С. Цвет, который еще в 1903 г. исполь­зовал этот метод для анализа и разделения хлорофилла.

Хроматография - физико-химический метод разделе­ния и анализа смесей веществ, основанный на много­кратно повторяющихся процессах сорбции и десорбции разделяемых веществ между подвижной и неподвижной фазами, что приводит к различию в скорости движе­ния этих веществ относительно неподвижной фазы.

Хроматографирование анализируемой смеси возможно при соблюдении следующих требований:

- разделяемые вещества должны иметь различные констан­ты сорбции по отношению к подвижной и неподвижной фазам;

— неподвижная фаза должна быть такой, чтобы процессы сорбции разделяемых веществ на ней были обратимы.

Сущность разделения веществ при хроматографировании за­ключается во введении разделяемой смеси из веществ X, Y, Z в хроматографическое устройство, содержащее неподвижную и под­вижную фазы. В соответствии с законами термодинамики и

Рис. 26.9. Схема хроматографического разделения смеси веществ

сорбсорбционного равновесия каждое вещество смеси будет распреде­ляться между контактирующими фазами в соответствии с его сродством к этим фазам (рис. 26.9).

Эти вещества будут перемещаться подвижной фазой вдоль неподвижной с разными скоростями. Чем больше сродство веще­ства к неподвижной фазе и меньше к подвижной фазе (вещество ), тем меньше скорость его движения с подвижной фазой относительно неподвижной. Обратная картина будет наблю­даться для вещества . Эти различия в свойствах веществ с течением времени обусловят их разделение в хроматографическом устройстве и приведут к появлению на неподвижной фазе отдельных зон, содержащих практически чистые разделяемые вещества. Таким образом, чем больше разница в сорбционной способности разделяемых веществ к подвижной и неподвижной фазам, тем больше разница в скоростях их перемещения по не­подвижной фазе и тем полнее их разделение.

Хроматографическая методика разделения веществ состоит из следующих этапов: 1) выбор и подготовка используемых об­разцов подвижной и неподвижной фаз; 2) нанесение анализируе­мой смеси на неподвижную фазу и введение подвижной фазы; 3) собственно хроматографирование, т. е. разделение веществ при движении подвижной фазы относительно неподвижной; 4) детек­тирование веществ, т. е. обнаружение местонахождения разде­ленных веществ на неподвижной фазе или в подвижной фазе после прохождения ее через неподвижную фазу; 5) количест­венное определение содержания веществ в разделенных зонах.

Эффективность хроматографического процесса зависит:

1. от физико-химических свойств неподвижной и подвиж­ной фаз;

2. от сродства разделяемых веществ к контактирующим фазам;

3. от условий хроматографирования (скорости движения под­вижной фазы, температуры, времени разделения).

Изменяя эти параметры, можно подобрать такие условия, которые позволят достигнуть разделения веществ с очень близ­кими физико-химическими свойствами, например изомеров.

Классификация хроматографических методов. В зависимо­сти от рассматриваемого признака хроматографического процес­са различают следующие виды хроматографии.

По цели проведения:

— аналитическая хроматография используется для качест­венного и количественного анализа смеси веществ;

- препаративная хроматография предназначена для выде­ления из смеси чистых компонентов или для очистки вещества от примесей.

П о агрегатному состоянию подвижной фазы хроматографию подразделяют на газовую и жидкостную.

Рис. 26.10. Схема газового хроматографа (а) и хроматограмма раз­деляемой смеси веществ (б)

В газовой хроматографии подвижной фазой является газ, который называется газ-носитель, а неподвижной фазой - твер­дый гранулированный адсорбент или нелетучая жидкость, нанесенная на твердый носитель. Неподвижная фаза находится в колонке, а в случае капиллярной колонки роль неподвижной фазы выполняют ее стенки. Газовую хроматографию применяют для разделения летучих термически устойчивых веществ с молекулярной массой до 200-300.

Для проведения газовой хроматографии используют хромато­граф (рис. 26.10). Анализируемая смесь вводится в испаритель, а оттуда с помощью газа-носителя попадает в колонку с неподвижной фазой, помещенную в термостат. Различные компоненты смеси перемещаются газом-носителем вдоль колонки с разными скоро­стями из-за разного сродства их к неподвижной фазе. Поэтому раз­деляемые вещества выходят из колонки в разное время и по от­дельности регистрируются детектором, который передает сигнал самописцу. В результате получается хроматограмма, представляющая собой несколько пиков, число которых зависит от числа присутст­вующих в смеси веществ, а площадь каждого пика пропорцио­нальна содержанию соответствующего вещества. Идентификация ве­щества проводится по времени удерживания, которое сравнивают со временем удерживания эталона при его хроматографировании на данной колонке при аналогичных условиях. Определение количе­ственного состава смеси выполняют, анализируя площадь получен­ных пиков для всех веществ, а относительное содержание каждо­го компонента равно отношению площади пика этого компонента Si к сумме площадей пиков всех компонентов смеси:

В жидкостной хроматографии подвижной фазой является жидкость, как чистая, так и смесь разных жидкостей. Непод­вижной фазой является твердый гранулированный адсорбент или тонкий слой жидкости, нанесенный на твердый носитель или содержащийся в нем. Жидкостная хроматография пригодна для разделения органических и неорганических веществ, включая и термически неустойчивые, а также веществ с большой моле­кулярной массой.

По применяемой технике эксперимента жидкостная хрома­тография в зависимости от размещения неподвижной фазы де­лится на плоскостную (тонкослойную или бумажную) и объем­ную (колоночную).

В тонкослойной хроматографии (ТСХ) в качестве твердой фазы используются силикагель (nSi02 • mН2О), оксид алюминия (AI2O3), целлюлоза или другие полимеры, которые наносятся тон­ким слоем на пластинку (рис. 26.11, а). Вблизи нижнего края пластинки на слой сорбента наносят пятно анализируемой смеси, а рядом по горизонтали - пятна известных соединений-свидете­лей. После высыхания пятен пластинку опускают в закрываю­щуюся камеру с подвижной фазой, которая поднимается по пла­стинке за счет капиллярных сил. Вместе с подвижной фазой по неподвижной фазе перемещаются нанесенные вещества, причем с разными скоростями, зависящими от их сорбционных свойств. Когда фронт подвижной фазы поднимется к верхнему краю пла­стинки, ее вынимают из камеры, высушивают, и, если анализи­руемые вещества не окрашены, то хроматограмму проявляют. Для этого хроматограмму или опрыскивают окрашивающим реа­гентом, или облучают ультрафиолетовым светом, или окрашива­ют, выдерживая в парах иода. При проявлении на хроматограмме в местах нахождения анализируемых веществ появляются пятна.

На рис. 26.11, б представлена тонкослойная хроматограмма, полученная при разделении смеси из трех веществ X, Y, Z. Для идентификации веществ используются соответствующие соединения-свидетели, а также значения фактора относительного

Рис. 26.11. Тонкослойная хроматография (а) и хроматограмма разде­ляемой смеси веществ (б)

удерживания Rf, представляющего собой отношение пути h(Х), пройденного веществом, к пути, пройденному подвижной фазой h(Ф) от линии старта до линии фронта:

Фактор относительного удерживания зависит от природы ана­лизируемых веществ, природы подвижной и неподвижной фаз, от условий хроматографирования. При одинаковых условиях ана­лиза фактор относительного удерживания является величиной, позволяющей идентифицировать компоненты смеси при помо­щи соединений-свидетелей.

Количественный анализ разделяемых веществ проводят пу­тем измерения оптической плотности пятна, образующегося при взаимодействии определяемого вещества с цветообразующим реа­гентом. Тонкослойная хроматография не требует сложной аппа­ратуры, проста в исполнении и дает надежные результаты при наличии соответствующих свидетелей. Тонкослойная хроматогра­фия включена в качестве стандартного метода анализа лекарст­венных препаратов в Государственную фармакопею России.

Наряду с тонкослойной хроматографией широко использует­ся бумажная хроматография, которая по технике исполнения близка к ТСХ и так же проста. В бумажной хроматограмме не­подвижной фазой является вода, входящая в состав бумаги.

Колоночная хроматография широко используется для ко­личественного разделения смесей. В этом случае в верхнюю часть колонки с сорбентом наносят анализируемую смесь и через слой сорбента медленно пропускают подвижную фазу. Этот процесс называют элюированием. Из-за разных сорбционных свойств ка­ждый компонент смеси имеет свое время удерживания, т. е. время прохождения через колонку. Последовательные порции элюента собирают в отдельные емкости, испаряют подвижную фазу, и получается чистый компонент.

В последнее время широкое применение для анализа неле­тучих веществ находит высокоэффективная жидкостная хро­матография (ВЭЖХ), которая осуществляется с помощью спе­циального хроматографа. В отличие от газовой хроматографии в этом случае через колонку с неподвижной фазой под давлени­ем пропускается жидкая подвижная фаза. В остальном ВЭЖХ подобна газовой хроматографии.

По механизму разделения веществ хроматографию подразде­ляют на адсорбционную, распределительную (абсорбционную), ионообменную, молекулярно-ситовую и биоспецифическую (аф­финную).

В адсорбционной хроматографии вещества разделяются бла­годаря различию их констант адсорбции в системах газ - твер­дый адсорбент или жидкость - твердый адсорбент.

В распределительной хроматографии разделение веществ про­исходит вследствие различия констант распределения при аб­сорбции веществ из газовой или жидкой подвижной фазы жидкой неподвижной фазой, которая обычно нанесена тонким сло­ем на твердый носитель.

В ионообменной хроматографии разделение ионов основано на различии их констант ионного обмена между раствором и ионитом.

В молекулярно-ситовой хроматографии (устаревшее назва­ние — гель-фильтрация) разделение смеси веществ происходит вследствие различий в размерах их частиц. В качестве непод­вижной фазы в этом случае используют вещества, имеющие поры строго определенного размера. К ним относятся цеолиты, декстриновые гели (сефадексы), гели агарозы (полисахариды из агар-агара), полиакриламидные гели. Молекулярно-ситовую хро­матографию в основном используют для выделения и очистки белков, нуклеиновых кислот и даже клеток (эритроцитов, лим­фоцитов).

Биоспецифическая хроматография основана на уникальной способности некоторых биологических субстратов избирательно взаимодействовать с определенными веществами, например фер­мента с субстратом, антигена с антителом, гормона с рецептором, благодаря чему достигается их эффективная очистка.

Хроматография широко применяется в медицине и биоло­гии для идентификации веществ, а также для решения большого числа исследовательских, диагностических, клинических, токсикологических задач. Качественный и количественный анализ кро­ви или мочи на присутствие в ней алкоголя, наркотиков, до­пинга осуществляется с помощью хроматографии за несколько минут. Для диагностики заболеваний желчного пузыря, печени, нарушений сердечной деятельности, заболеваний центральной нервной системы, сахарного диабета, гипертонической болезни определяют хроматографическим анализом качественный со­став и количественное соотношение жирных кислот в опреде­ленных физиологических средах. В гигиене и санитарии хрома­тография используется для контроля окружающей среды.