3.1 Радиальная хроматография

Нанесение раствора на хроматографическую бумагу:

Берут беззольный фильтр из быстрофильтрующей бумаги диаметром 11-14 см. Фильтр перегибают по диаметрам, перпендикулярным друг другу. В точке пересечения линий сгиба (центр фильтра) вырезают отверстие диаметром около 3 мм. На расстоянии около 1 см от центрального отверстия простым карандашом отмечают точки. В эти точки при помощи калиброванных стеклянных капилляров объемом 5 мкл наносят исследуемые растворы. В каждую точку наносят один полный капилляр. В одну из точек наносят исследуемую смесь аминокислот. В оставшиеся точки наносят растворы аминокислот – «стандартов», входящих в смесь: пролина, аспарагиновой кислоты, изолейцина. После нанесения каждой капли раствора бумагу просушивают в токе теплого воздуха и лишь затем наносят следующую каплю. Каплю наносят с расчетом, чтобы пятно от неё не превышало 3 мм по диаметру. После нанесения подписывают простым карандашом у наружного края диска что и где было нанесено. Для нанесения используют растворы аминокислоты пролина, аспарагиновой кислоты, изолейцина по 5 мг/мл в 0,5 н. НCl и их равнообъемную смесь. Хроматограмму тщательно высушивают.

Проведение хроматографии:

Из второго фильтра вырезают полоски шириной около 1,5 см, длиной 5-7 см. Эти полоски сворачивают в как можно более тонкие трубочки, которые затем вставляют в центральное отверстие дисков (делают фитиль). Хроматограмму с фитилем помещают между двумя половинками чашек Петри с одинаковым диаметром, образующими хроматографическую камеру, так, чтобы фитиль хроматограммы был погружен в систему растворителей, которую наливают в нижнюю чашку. В качестве системы растворителей используют: н-пропанол-аммиак-вода в объемном отношении 6:3:1. Хроматографическое разделение проводят при комнатной температуре в течение 30 -40 мин.

Насыщенный водой растворитель впитывается фитилем и движется по бумажному диску, увлекая нанесенные вещества. Этот приводит к разделению исследуемой смеси на отдельные аминокислоты, соответственно коэффициентам их хроматографической подвижности

Обнаружение аминокислот:

По истечении 30-40 мин, когда фронт растворителя пройдет путь около 4-5 см, хроматограмму извлекают из камеры, тщательно сушат в течении 4-5 мин в потоке воздуха при температуре 60-80С для удаления растворителя. После этого хроматограмму опрыскивают из пульверизатора раствором нингидрина в ацетоне и помещают в поток горячего воздуха на 5 минут при температуре 80С. На хроматограмме появляются цветные пятна. Каждое пятно соответствует отдельной аминокислоте (желтое – пролин, серо-синее – аспарагиновая кислота, красно-фиолетовое – изолейцин). Сопоставляя положение пятен исследуемого раствора с положением пятен «стандартов», определяют наличие тех или иных аминокислот в исследуемой смеси (рис. 9)

Рис. 9. Радиальная хроматограмма