III Методы анализа аминокислот
Распределительная хроматография аминокислот
Распределительная хроматография – метод анализа аминокислот и их смесей. Задача анализа смесей аминокислот часто встречается в случае анализа (экспертизы качества, определения подлинности) лекарственных препаратов, биологически активных добавок, продуктов питания и кормов. В последних двух случаях этот анализ также необходим для определения пищевой ценности. В биохимической исследовательской практике хроматография аминокислот применялась для определения аминокислотного состава белков и исследования обмена веществ.
Метод распределительной хроматографии используется для разделения аминокислот. В основе метода лежит тот факт, что аминокислоты имеют разную растворимость в разных растворителях. В распределительной хроматографии всегда используется два растворителя, не смешивающихся друг с другом. Эти растворители называют «фазы». Для анализа разных веществ используются разные фазы и их сочетания, а выбор фаз зависит от структуры разделяемых веществ. Тем не менее, для одного анализа всегда нужно только две фазы. В случае распределительной хроматографии на бумаге или силикагеле одной из фаз является вода, другой – органический растворитель (или их смесь), насыщенный водой. Вода в данном случае неподвижна (неподвижная фаза), так как сорбирована (неподвижно закреплена) на инертном носителе (целлюлозе, силикагеле), который в атмосферном воздухе удерживает до 15% воды, оставаясь внешне сухим. Насыщенный водой органический растворитель (подвижная фаза) перемещается относительно неподвижной фазы за счет капиллярного эффекта. Чем больше растворимость аминокислот в воде (неподвижной фазе) и меньше в органическом растворителе (подвижной фазе), тем медленнее движется аминокислота по носителю. При этом аминокислоты перемещаются по носителю за счет движения подвижной фазы.
Выполнение метода сводится к тому, что на хроматографическую бумагу или силикагель (инертный носитель) в одну точку наносят исследуемый раствор смеси аминокислот и высушивают. Бумагу или пластинки с силикагелем приводят в контакт со смесью органических растворителей, которые вследствие капиллярного эффекта перемещаются по носителю. По мере продвижения растворителя смесь аминокислот будет разделяться, причем те из них, которые растворяются в органическом растворителе больше, продвигаются вдоль носителя дальше, чем те, что растворяются меньше. Когда фронт растворителя приближается к противоположному краю носителя, процесс прекращают и бумагу или пластинку с силикагелем высушивают. Аминокислоты, на полученной таким образом хроматограмме, обнаруживают с помощью реагента, дающего с аминокислотами цветную реакцию. Отдельные аминокислоты обнаруживаются в виде цветных пятен, расположенных на разных расстояниях от места нанесения исследуемой смеси.
Скорость перемещения отдельных аминокислот может быть выражена посредством величины их хроматографической подвижности (Rf). Хроматографической подвижностью называется отношение расстояния от места нанесения аминокислоты до середины её пятна к расстоянию от места нанесения аминокислоты до фронта растворителя:
Величина Rf является характерной величиной для каждой аминокислоты и постоянна при данных условиях опыта (растворитель, температура, носитель и др.).
Наиболее часто идентификация аминокислот на хроматограммах проводится путем использования чистых аминокислот – «стандартов», наносимых на ту же хроматограмму.
Распределительная хроматограмма может быть выполнена несколькими способами. Ниже приводится два способа такой хроматографии.
В качестве отчета о проделанной работе:
1. Заполните таблицу
Носитель |
Rf |
||
аспарагиновая кислота |
пролин |
изолейцин |
|
хроматографическая бумага |
|
|
|
силикагель
|
|
|
|
2. Приложите полученные хроматограммы