2.1 Метод ультрафиолетового поглощения

Метод основан на способности ароматических аминокислот (триптофана, тирозина и в меньшей степени фенилаланина) поглощать ультрафиолетовый свет с максимумом при 280 нм. Измеряя величину оптической плотности при этой длине волны, можно найти концентрацию белка в растворе. Интенсивность поглощения света разными белками в ультрафиолетовой области спектра может сильно различаться вследствие разного содержания ароматических аминокислот. Условно считают, что при концентрации «усредненного» белка в растворе, равной 1 мг/мл, величина оптической плотности при 280 нм равна 1,0 (при толщине слоя жидкости в 1 см)

Определению белка данным методом мешает присутствие нуклеиновых кислот и нуклеотидов. Этих затруднений можно избежать, измеряя оптическую плотность раствора при 260 нм (для учета поглощения соединений нуклеотидной природы) и 280 нм. Содержание белка, в этом случае, можно найти по формуле Калькара:

С(мг/мл)=1,45А₂₈₀ – 0,74А₂₆₀

Также, концентрацию белка в растворе можно определить с помощью метода калибровочного графика, используя измерение только при длине волны 280 нм.

Ход работы:

Пять пробирок подписать от «1» до «5»

Приготовить серию растворов для построения калибровочного графика.

Для этого в каждую из шести пробирок внести с помощью автоматической пипетки на 1000 мкл аликвоту физраствора (0,9%-ный раствор NaCl в дистиллированной воде) и исходного раствора белка с концентрацией 2,5 мг/мл :

номер пробирки	аликвота физраствора	аликвота раствора белка	концентрация белка
1	3500 мкл	500 мкл	0,31 мг/мл
2	3000 мкл	1000 мкл	0,62 мг/мл
3	2000 мкл	2000 мкл	1,24 мг/мл
4	1000 мкл	3000 мкл	1,86 мг/мл
5	0	4000 мкл	2,5 мг/мл

Каждый из полученных растворов, начиная с «1» (раствор с наименьшей концентрацией белка) и до «5» (концентрация белка максимальна) поочередно поместить в стандартную кварцевую кювету и измерить оптическую плотность при длине волны 280 нм. Растворы фотометрировать против чистого физраствора.

После фотометрирования построить калибровочный график: по оси «y» отложить значения оптической плотности, по оси «х» - концентрацию белка в фотометрированных растворах. График должен представлять собой прямую линию, выходящую из начала координат.

После построения калибровочного графика измерить оптическую плотность выданного раствора белка с неизвестной концентрацией при длинах волн 280 нм и 260 нм. Определите концентрацию белка по калибровочному графику и по формуле Калькара.

2.2 Биуретовый метод (микро-модификация)

В основе данного метода определения концентрации белка лежит, уже известная вам из I раздела, биуретовая реакция. Данный метод имеет несколько разных вариантов, различающихся необходимыми для анализа объемами проб, интервалами определяемых концентраций, составом реакционной смеси. Общим для всех методов является сильнощелочная среда реакции и наличие ионов двухвалентной меди. Определению мешает присутствие солей аммония.

Ход работы:

Пять пробирок подписать от «1» до «5»

Приготовить серию растворов для построения калибровочного графика.

Для этого в каждую из пяти пробирок внести с помощью автоматической пипетки на 1000 мкл и 200 мкл аликвоту физраствора (0,9%-ный раствор NaCl в дистиллированной воде) и исходного раствора белка с концентрацией 5 мг/мл :

номер пробирки	аликвота физраствора	аликвота раствора белка	концентрация белка
1	1950 мкл	50 мкл	0,125 мг/мл
2	1900 мкл	100 мкл	0,25 мг/мл
3	1800 мкл	200 мкл	0,5 мг/мл
4	1700 мкл	300 мкл	0,75 мг/мл
5	1600 мкл	400 мкл	1 мг/мл

В каждую пробирку добавляют 2 мл 6%-ного раствора NaOH и перемешивают

Затем в каждую пробирку добавить 0,2 мл реактива Бенедикта, перемешать.

Шестую пробирку подписать «Х» (холостая), внести в неё 2 мл физраствора, а затем раствор едкого натра и реактив Бенедикта как описано выше.

Инкубировать 15 минут.

Каждый из полученных растворов, начиная с «1» (раствор с наименьшей концентрацией белка) и до «5» (концентрация белка максимальна) поочередно поместить в стандартную стеклянную кювету и измерить оптическую плотность при длине волны 330 нм. Растворы фотометрировать против холостой пробы.

После фотометрирования построить калибровочный график: по оси «y» отложить значения оптической плотности, по оси «x» - концентрацию белка в фотометрированных растворах. График должен представлять собой прямую линию, выходящую из начала.

С выданным раствором белка (2 мл) с неизвестной концентрацией провести все манипуляции как описано выше и измерить его оптическую плотность против холостой пробы.

По полученному калибровочному графику определить концентрацию белка.

Вопросы для самоподготовки

Какие фотометрические методы определения белка вы знаете?

На чем основано определение белка методом ультрафиолетового поглощения?

Какие соединения мешают определению белка методом ультрафиолетового поглощения?

Какая качественная реакция лежит в основе биуретового метода определения белка, что эта реакция открывает?

Какие соединения мешают определению белка биуретовым методом?

В каких областях деятельности используется количественное определение белка?

Что такое оптическая плотность, запишите выражение для оптической плотности (закон Бугера-Ламберта-Бера)?

Что такое спектрофотометр, перечислите его основные узлы?