1.4 Ксантопротеиновая реакция
Ксантопротеиновая реакция указывает на присутствие в белке ароматических радикалов, которые входят в состав аминокислот фенилаланина, тирозина, триптофана. При добавлении к раствору бека концентрированной азотной кислоты белок сначала выпадает в осадок, а затем, при нагревании, растворяется и жидкость окрашивается в желтый цвет.
Реакция характерна для бензольного ядра циклических аминокислот, которые при обработке концентрированной азотной кислотой подвергаются нитрованию:
Нитропроизводные аминокислот в щелочной среде, например при добавлении водного раствора аммиака, образуют соли хиноидной структуры, окрашенные в оранжевый цвет.
Аналогично протекает реакция нитрования триптофана и фенилаланина, последний нитруется труднее. Ксантопротеиновую реакцию дают практически все белки, за исключением желатина и нескольких других белков, в молекулах которых почти полностью отсутствуют ароматические аминокислоты.
Очень похожа на ксантопротеиновую реакцию реакция Милона – их механизм полностью аналогичен. Различия заключаются лишь в том, что из всех ароматических аминокислот в реакцию Милона вступает только тирозин, а получение оранжевого (красно-коричневого в случае реакции Милона) солеобразного соединения здесь происходит в одну стадию, а не в две как в ксантопротеиновой теакции. Реактив Милона представляет собой раствор нитрата ртути (II) в концентрированной азотной кислоте.
Ход работы:
В одну пробирку наливают 0,5 мл 1%-ного раствора яичного белка, во вторую 0,5 мл 1%-ного раствора желатина. В обе пробирки добавляют по 3 капли концентрированной азотной кислоты (ОСТОРОЖНО!) нагревают. В пробирке с яичным белком жидкость окрашивается в лимонно-желтый цвет, а в пробирке с желатиной появляется едва заметное бледно-желтое окрашивание, обусловленное незначительной примесью других белков. Пробирки охлаждают, после этого в них осторожно добавляют по 1,0 мл 30%-ного раствора гидроксида натрия. В пробирке с яичным белком окраска переходит в оранжевую.
1.5 Нингидриновая реакция
Нингидриновая реакция позволяет обнаружить свободные аминогруппы. Кроме α-аминогрупп, входящих в состав пептидной связи, в молекуле белка присутствуют свободные аминогруппы, входящие в состав боковых радикалов аминокислот (например, лизина, глутамина). В результате добавления к растворам белков и пептидов раствора нингидрина (трикетогидриндегидрата) при нагревании развивается синее или фиолетовое окрашивание. Реакция протекает в две стадии.
На 1-й стадии образуется восстановленный нингидрин за счет окислительного дезаминирования и декарбоксилирования аминокислот. Также на этой стадии образуется аммиак.
На 2-й стадии реакции образовавшийся аммиак реагирует с эквимолярным количеством окисленного и восстановленного нингидрина, образуя сине-фиолетовый продукт конденсации (пурпур Руэмана) с максимумом поглощения при 540 нм (для пролина при 440 нм, окрашивание желтое).
Интенсивность окраски пропорциональна количеству аминогрупп, поэтому реакция может быть использована для количественного определения аминокислот. Также нингидриновая реакция используется для обнаружения аминокислот в хроматографии.
Ход работы:
В одну пробирку вносят 0,5 мл 1%-ного раствора яичного белка, в другую – 0,5 мл 1%-ного раствора желатины. В каждую пробирку добавляют по 0,2 мл 0,5%-ного раствора нингидрина и нагревают до кипения на спиртовке. Через 2-3 минуты в обеих пробирках появляется розовое, красное, а затем сине-фиолетовое окрашивание.