4.2. Влияние нейтральных солей на растворимость белков

Нейтральные соли (например, Na₂SO₄, NaCl, (NH₄)₂SO₄) в небольших концентрациях повышают растворимость белков в воде вследствие того, что они увеличивают степень диссоциации ионизированных групп белка и способствуют его гидратации.

Высокие концентрации нейтральных солей, напротив, осаждают (высаливают) белки из водных растворов. При растворении нейтральных солей их ионы конкурируют с молекулами белка за воду, необходимую для формирования гидратных оболочек. Высокая концентрация ионов нейтральных солей «оттягивает к себе» молекулы воды от белка, лишая его гидратной оболочки. Высаливание белков является обратимым процессом. Если удалить соль (при разбавлении водой, путем диализа или другим способом) белок вновь гидратируется. Высаливание часто используется в научно-исследовательской работе при очистке белков или в производстве медицинских препаратов иммуноглобулинов из сыворотки крови.

Ход работы

В пробирку №1 вносят 0,2 мл неразведенного яичного белка и 2 мл воды, содержимое перемешивают. При этом яичный альбумин растворяется, а яичный глобулин выпадает в виде небольшого осадка (или смесь мутнеет).

В пробирку №2 вносят 0,2 мл неразведенного яичного белка и 2 мл 5%-ного раствора хлорида натрия. В слабом солевом растворе растворяются и альбумины и глобулины.

В пробирку №3 наливают 2 мл яичного белка, добавляют равный объем насыщенного раствора сульфата аммония, содержимое перемешивают (получают полунасыщенный раствор сульфата аммония). При этом выпадает осадок яичного глобулина. Через 5 мин осадок отфильтровывают. В фильтрате остается другой белок – яичный альбумин. Для фильтрования раствора белка используют складчатый фильтр из быстрофильтрующей бумаги, который предварительно смачивают небольшим количеством дистиллированной воды.

Для высаливания альбумина к фильтрату добавляют измельченный порошок сульфата аммония до полного насыщения, т.е. пока не прекратится растворение соли. Выпавший осадок альбумина отфильтровывают и с фильтратом проделывают биуретовую реакцию. Отрицательная биуретовая реакция указывает на отсутствие белка

4.3 Осаждение при нагревании

При температуре выше 50°С почти все белки претерпевают тепловую денатурацию. При этом, на выпадение белков в осадок значительное влияние оказывают присутствие электролитов и рН среды. Наиболее полное и быстрое осаждение происходит в изоэлектрической точке, т.е. при такой величине рН, когда коллоидные частицы белка являются наименее устойчивыми. Поэтому для полного осаждения белка при нагревании следует создать реакцию среды, соответствующую его изоэлектрической точке (белки, обладающие кислыми свойствами, осаждают в слабокислой среде, белки, обладающие щелочными свойствами - в слабощелочной).

В сильнокислых (за исключением азотной, трихлоруксусной и сульфосалициловой кислот) и сильнощелочных растворах денатурированный при нагревании белок не выпадает в осадок, так как частицы белка перезаряжаются (или происходит усиление имеющегося заряда). Они несут в первом случае положительный, во втором случае – отрицательный заряд, что повышает их устойчивость в растворе в результате электростатических сил отталкивания. Однако нагревание в сильнокислых растворах в присутствие достаточного количества какой-либо нейтральной соли белки могут выпадать в осадок.

Ход работы.

В 5 пронумерованных пробирок наливают по 1 мл 1%-ного раствора яичного белка.

Содержимое первой пробирки нагревают на спиртовке. Жидкость мутнеет, но так как частицы денатурированного белка несут заряд, они удерживаются во взвешенном состоянии (яичный альбумин является кислым белком и в нейтральной среде заряжается отрицательно).

В пробирку 2 добавляют 500 мкл 1%-ного раствора уксусной кислоты и нагревают. Выпадает осадок вследствие того, что белок теряет заряд и приближается к изоэлектрическому состоянию.

В пробирку 3 добавляют 100 мкл 10%-ного раствора уксусной кислоты и содержимое нагревают. Осадок белка не образуется, даже при кипячении, так как в сильнокислой среде частицы белка перезаряжаются, приобретая положительный заряд.

В 4 пробирку добавляют 100 мкл 10%-ного раствора уксусной кислоты и 100 мкл насыщенного раствора хлорида натрия. Образуется осадок белка вследствие адсорбции ионов хлорид-иона (образование двойного электрического слоя) и нейтрализации положительного заряда на частицах белка.

в пробирку 5 добавляют 100 мкл 10%-ного раствора гидроксида натрия и нагревают. Осадок белка не образуется даже при кипячении, так как в щелочной среде отрицательный заряд на частице белка усиливается.

Результаты этой и последующих работ раздела «Осаждение белков» вносят в таблицу 7.