3.2 Тонкослойная хроматография
Для тонкослойной хроматографии аминокислот используют готовые коммерческие пластинки. В качестве подложки для изготовления этих пластинок используется алюминиевая фольга. На ней нанесен тонкий слой крупнопористого силикагеля, связанный золем кремниевой кислоты, для придания этому слою большой механической прочности.
Из выданного листа 20х20 см вырезать пластинку 5х8 см. На пластинке отметить 4 стартовые точки на расстоянии 1 см от узкого края. На одну из этих точек наносят смесь аминокислот, а на остальные – отдельные аминокислоты в качестве «стандартов». Растворы аминокислот наносят, как описано для радиальной хроматографии, но в этом случае вещество наносят не в точку, а зону нанесения растягивают в небольшую полоску длиной 3-5 мм (рис. 10).
После тщательного высушивания нанесенных пятен, хроматографическую пластинку помещают в хроматографическую камеру. Узкий конец пластинки погружают на 0,5 см в систему растворителей таким образом, чтобы места нанесения аминокислот остались над растворителем. Хроматографию проводят при комнатной температуре в течение 20-30 мин, пока фронт растворителя не пройдет расстояние 5-6 см от места нанесения аминокислот. После этого пластинку вынимают из камеры, отмечают положение фронта растворителя, высушивают, опрыскивают нингидрином и проявляют в токе горячего воздуха, как описано для радиальной хроматографии.
Рис. 10. Тонкослойная хроматограмма
3.3 Определение содержания аминокислот формольным титрованием
Метод формольного титрования (или титрование по Сёренсену) применяется для определения количество аминокислот, присутствующих в образце. Определение аминокислот используется для контроля качества лекарств, пищевых добавок и кормовых смесей, культуральных сред в микробиологии и биотехнологии (в том числе культуре ткани клеток растений и животных), также определение аминокислот необходимо для контроля качества сырья и химических технологических процессов.
Суть формольного титрования состоит в том, что аминогруппы аминокислот блокируются формальдегидом, а оставшиеся свободные карбоксильные группы титруют щелочью:
По количеству пошедшей на титрование щелочи определяют количество СООН-групп. В среднем число карбоксильных групп в аминокислотах принимают равным числу аминогрупп (что вполне справедливо для моноаминокислот, для диаминокислот вводятся соответствующие поправки в методику титрования). Также формольным титрованием могут определяться соли аммония (присутствие которых в пробе будет мешать определению аминокислот).
В данной работе вам предлагается определить содержание аминокислоты L-глицина (моль-масса 75,1 г/моль) в лекарственном препарате (таблетки «Глицин-Био»).
В качестве отчета о проделанной работе:
Запишите схемы реакций
Заполните таблицу
масса пустого стакана(г):
масса стакана с таблетками (г):
масса таблеток (г):
объем щелочи, пошедший на титрование(мл):
опытной пробы
контрольной пробы
1.
1.
2
2.
3
3.
масса глицина в одной таблетке (мг):
приведите расчет содержания глицина в одной таблетке по формуле.
Для количественного определения аминокислот методом формольного титрования приходится пользоваться микробюретками в связи с малым количеством анализируемого вещества. Микробюретки позволяют проводить достаточное точное титрование при объемах титранта от 0,5 до 5 мл. Наиболее часто используется микробюретка Банга (рис. 11)
Приступая к работе с микробюреткой необходимо заполнить титрантом резервуар 1, а затем удалить все воздушные пузыри из трубки для заполнения бюретки и её мерного колена, поочередно открывая и закрывая краны 3 и 4. При этом стоить быть осторожным: не допускать переполнения мерного колена и выплескивания титранта, а также опорожнения резервуара 1 так как последнее приводит к необходимости повторно выгонять воздушные пузыри из бюретки. Затем бюретку необходимо троекратно промыть раствором титранта путем заполнения и опорожнения мерного колена. По окончании работы бюретку необходимо трижды промыть дистиллированной водой. Оставлять титрант в бюретке нельзя, так как это приводит к заеданию кранов и выходу бюретки из строя (особенно, если титрант – раствор щелочи)
Рис. 11. Микробюретка Банга.
1-резервуар для титранта, 2- трубка для заполнения бюретки, 3 – кран для заполнения бюретки, 4 – кран для титрования, 5 – подставка, 6 – мерное колено бюретки.
Ход работы:
На аналитических весах взвесить стакан объемом 100 мл
Поместить в стакан 2 таблетки глицина по 100 мг, взвесить стакан вторично
По разнице масс определить массу таблеток.
Внести в стакан 50 мл дистиллированной воды, при помощи мерного цилиндра. Растворить таблетки, при перемешивании стеклянной палочкой.
Профильтровать раствор через складчатый фильтр в мерную колбу
Обмыть стаканчик и палочку дистиллированной водой трижды (примерно по 10 мл). Промывные воды также профильтровать в мерную колбу
Довести дистиллированной водой до метки. Перемешать
Провести контрольное титрование:
Пипеткой Мора отобрать 10 мл дистиллированной воды в коническую колбу объемом 25 мл.
Пипеткой мора прилить 5 мл формольной смеси.
Титровать ~0,1 н. раствором едкого натра из микробюретки до слабо-розовой окраски.
Записать объем щелочи, пошедший на контрольное титрование.
Титрование проводится трижды.
Затем провести опытное титрование следующим образом: к 10 мл полученного раствора таблеток прилить 5 мл формольной смеси и титровать ~0,1 н. раствором едкого натра из микробюретки до слабо-розовой окраски.
Записать объем щелочи, пошедшей на опытное титрование.
Титрование проводится трижды.
Рассчитать количества глицина Х (мг) в 1 таблетке по следующей формуле:
где А0 и Ак – количество 0,1 н. раствора гидроксида натрия, пошедшего на титрование опытной и контрольной проб соответственно, мл; 7,51 – количество глицина (мг), соответствующее 1 мл 0,1 н. раствора гидроксида натрия (1 мл нормального раствора щелочи соответствует 75,1 мг глицина азота); 100 – общий объем раствора для анализа, мл; 10 – объем раствора, взятого для титрования, мл; 2 – количество таблеток, взятых на анализ; Т/0,1 – нормальность раствора едкого натра деленная на 0,1.
Точное значение нормальности раствора едкого натра сообщает преподаватель.
Вопросы для самоподготовки
В чем практическое значение формольного титрования?
На каких реакциях основано формольное титрование?
На каком принципе основана распределительная хроматография аминокислот?
Что такое фаза?
В чем разница между подвижной и неподвижной фазами?
Что такое хроматографическая подвижность, от чего она зависит?
Что такое Rf, запишите выражение для этой величины?
С помощью какой реакции обнаруживают аминокислоты на хроматограммах?
В чем практическая значимость распределительной хроматографии аминокислот?