Розділ 20 тканинна інженерія

Тканинна інженерія знайшла своє застосування в пластичній хірургії задовго до того, як технічний прогрес дозволив цій галузі розширитися до її нинішніх розмірів. Тканинна інженерія і пластична хірургія мають загальну мету - забезпечення тканинами для лікування вроджених або набутих дефектів. Кожне нове досягнення в цих галузях - результат багатовікових досліджень, спостережень і відкриттів. З історичної точки зору, дуже цікаво спостерігати розвиток тканинної інженерії в контексті традицій пластичної хірургії, як початок хірургії майбутнього. На сьогодні досягнення тканинної інженерії продовжують відкривати нові можливості для пластичних хірургів.

Технічні нововведення XX століття зробили революцію в пластичній хірургії. Були розроблені і постійно вдосконалюються операційні мікроскопи, а виробництво мікрохірургічних інструментів в короткі строки з пробного стало повсюдним. Разом з цими удосконаленнями наступила ера мікрохірургії, самою багатообіцяючою з існуючих методик пересадки тканин. Серед інших досягнень, які принесла нам ця нова галузь науки, були вдосконалені і давно вже відомі хірургічні втручання. Опис щонайтонших деталей будови ангіосомів, тобто анатомії кровопостачання конкретної ділянки тіла, ліг в основу розробки безлічі нових методик.

Нововведення, що разюче змінили обличчя пластичної хірургії, дали початок новим дослідженням. Прогрес наукових технологій дозволив отримати нові дані про структурні і функціональні взаємовідносини, які виявляються на мікроскопічному рівні, як в здорових, так і в патологічно змінених тканинах. Ці базисні знання, разом з досягненнями в культивуванні клітин і біомедичними дослідженнями, відкрили нові можливості для давно існуючого задуму - заміщати пошкоджені тканини біологічним матеріалом, що отриманий в лабораторних умовах. Науковий прогрес кінця XX ст. зробив ще один крок до здійснення цієї мети: зародилася і стала розвиватися нова наука - тканинна інженерія.

Основні принципи тканинної інженерії

В порівнянні з пластичною хірургією, тканинна інженерія - молодша галузь науки, метою якої є проведення досліджень з живими тканинами поза організмом. Це результат взаємодії великого числа природних наук, у тому числі біотехнології, матеріалознавства, біології клітини, культивування клітин, а також ряду інших медичних спеціальностей.

Суть тканинної інженерії глибша, ніж можна подумати, виходячи з сучасного визначення. До недавнього часу можливості трансплантології обмежувалися полімерними синтетичними імплантатами і трансплантатами, узятими від самого пацієнта, від донора або трупа. Поява тканинної інженерії стала наслідком незадоволення традиційними матеріалами, використовуваними для заміщення пошкоджених тканин, які не завжди відповідають сучасним вимогам. Ось чому пошук рішень вийшов за межі звичних рамок.

Для заміщення тканин з метою відновлення структури і функції пластична хірургія удавалася до описаних вище методик. Самі по собі ці процедури досі не можуть забезпечити матеріал, необхідний для лікування широкого ряду дефектів. Загибель тканин – ось найбільша проблема, з якими зустрічається сучасна система охорони здоров'я. Проте в трансплантології існують серйозні обмеження, такі як нестача донорського матеріалу, висока вартість лікування, побічні ефекти імуносупресорної терапії і висока захворюваність реципієнтів.

Інший варіант лікування - використання синтетичних імплантатів, теж спричиняє за собою масу обтяжуючих чинників. Такі протези відновлюють структуру, але не можуть повністю забезпечити функцію високоорганізованої тканини або органу. Не можуть вони запобігти і прогресуюче погіршення стану пацієнтів, як наслідок прогресу захворювання, що спочатку привело до необхідності протезування.

Тканинна інженерія, ймовірно, допоможе знайти вихід з цих труднощів шляхом розробки біологічних матеріалів, призначених для лікування структурних і функціональних порушень тканин людського організму. Тканинна інженерія основана на знаннях, отриманих іншими галузями науки. Ці знання дозволяють зрозуміти процеси, що відбуваються в тканинах та їх структурно-функціональні взаємовідносини, які можна виявити тільки на мікроскопічному рівні. Більше того, тканинна інженерія дозволяє за допомогою цих знань створювати in vitro людські тканини, а також отримувати сурогати, біологічно з ними порівнянні. Нині досліджується можливість отримання лабораторним шляхом практично усіх видів тканин людини, які потім можна використовувати для відновлення, збереження або поліпшення структури і функції тканин людського організму.

Тканинна інженерія включає три основні напрями:

1. Культивування клітин і тканин.

2. Тривимірний матрикс в тканинній інженерії.

3. Біологічні матеріали, що використовуються в тканинній інженерії.

Перші кроки в клітинному культивуванні були зроблені Рудольфом Вірховим. Саме він був одним з перших прибічників теорії клітинної тотипотентності, тобто здібності єдиної клітини ділитися і давати почало усім видам диференційованих клітин організму. Він припустив, що клітина, відокремлена від популяції або витягнута з тканини, здатна рости під впливом специфічних зовнішніх дій. Проводилася безліч експериментів, покликаних підтвердити або спростувати цю теорію. Arnold, в 1887 р. спостерігав мітотичне ділення лейкоцитів в культурі. Це було першим кроком на шляху до підтримки життєздатності і, надалі, отримання живих тканин поза людським організмом. Всього через 10 років, в 1898 р., Ljunggren зміг провести експеримент з підтримки життєздатності частинок шкіри в рідкому середовищі. Ймовірно, це було першим досягненням на шляху до створення середовища, в якому могла існувати жива тканина поза організмом.

Приблизно в той же час, коли Lexer зробив першу маммопластику, в 1912 р., Саrrel отримав клітини, що діляться, на скляній підкладці. Термін in vitro виник саме тоді, як синонім будь-якого експерименту, що проводиться поза живим організмом. З настанням ери експериментів in vitro стало зрозуміле, навіть без технологій, відомих сучасним ученим, і знань, здобутих за допомогою цих технологій, що склад середовища, в якої клітини знаходяться поза організмом, дуже важливий для підтримки їх життєздатності, ділення і диференціювання.

Одне із завдань культивування - отримати відповідне оточення для підтримки клітинної активності, функцій і зростання. Термін "culture medium" з'явився в 1950-х роках. Тоді він використовувався для позначення суміші солей, поживних речовин, амінокислот і вітамінів, яка була потрібна для підтримки живих клітин in vitro; часто для більшої ефективності до суміші додавали сироватку. Першим, хто зміг створити безсироваткове середовище для клітин, був Ham (1965 р).

На сьогодні існує безліч середовищ для культивування самих різних типів клітин. Численні і самі методи клітинного і тканинного культивування. Найвідоміша і найбільш поширена методика вирощування клітин тварин і людини - одношарова культура в чашках полістиролів. Клітини більшості типів міцно прикріпляються до гідрофобної основи цих чашок протягом одного дня, після чого починають рости. Клітинні лінії, отримані таким чином, називаються первинними культурами (рис. 20.1).

Для того, щоб створити культивованим клітинам оптимальні умови, вони мають бути спочатку звільнені від позаклітинного матриксу, який оточує їх в живому організмі. Зв'язок клітин і міжклітинної речовини складний; для того, щоб розділити їх, треба не просто зруйнувати компоненти матриксу, але і розірвати їх з'єднання з клітинами, а також специфічні міжклітинні контакти. Для цього часто використовують ферменти, такі як колагенази і трипсин.

Після початкового періоду тривалістю 1-2 тижні, клітини, відокремлені від основної речовини, звикають до умов середовища і починають розмножатися. Залежно від типу клітин це може тривати до декількох тижнів. Коли кількість клітин зростає до певного рівня, вони починають злипатися - цей стан називається контактним гальмуванням або заростанням. Якщо клітини повинні і далі ділитися, на цьому етапі частину їх можна відсіяти в іншу чашку з середовищем. Цю маніпуляцію називають пасаж. Ділення клітин можна підтримувати на відносно постійному рівні протягом багатьох тижнів, якщо всякий раз після досягнення контактного гальмування розділяти культуру таким чином. В цьому випадку буде отримана величезна кількість клітин.

За такою схемою дуже швидко розмножуються in vitro диплоїдні дермальні фібробласти людини. Можна отримати первинну культуру з декількох тисяч фібробластів з фрагмента шкірної біопсії площею не більше 1 см². Культури людських фібробластів, що періодично піддаються пасажу можуть принести 1016 клітин, якщо їм забезпечені відповідні умови. На жаль, не усі типи клітин можуть бути так успішно культивовані. Крім того, за спостереженнями учених, багато ліній клітин змінюють свої біохімічні властивості in vitro. Так, хондроцити, що культивуються in vitro, замість характерного для них колагену II типу продукують колаген I типу, що робить їх фенотипічно схожими на фібробласти. Цей процес зазвичай пояснюють дедифференціюванням. Цікаво, що, якщо використовувати певне середовище, дедифференційовані хондроцити можуть редифференціюватися в типові форми. Такі клітини вже можна використовувати in vitro.

З часів перших гіпотез і досягнень в галузі культивування пройшло більше ста років, і по теперішній час розроблено і успішно використовується велика кількість методів культивування клітин і тканин. Наприклад, суспензійна, органна, губчаста, роллерна, перфузійна культури, мікросубстрат. Кожна культура враховує живильні, механофізіологічні і біохімічні потреби тієї клітинної лінії, для розмноження якої використовується (рис. 20.2).

Створюючи заміну для людських тканин, що втратили структуру або функцію, доцільно задатися питанням, як конгломерат клітин перетворюється в єдине ціле, у функціональну тканину або орган. Таку ж організацію і функціональність треба надати біологічному сурогату, покликаному замінити, відновити або поліпшити власну тканину. Іншими словами, для досягнення оптимального результату клітини у складі штучно створеної тканини повинні мати все ті ж властивості, що і клітини замінюваної частини тіла, як в структурному, так і у функціональному відношенні. Тобто ці клітини, окрім іншого, мають бути здатними до ділення і диференціювання, до взаємодії один з одним і з елементами що оточує їх середовища; вони повинні адекватно реагувати на сигнали організму-хазяїна, а в деяких випадках і самі подавати специфічні сигнали. Завдяки багаторічним дослідженням, сьогодні світова наука підійшла до відповіді на питання, що ж контролює усі ці процеси. Вирішальну роль грає взаємодія клітин з оточенням їх позаклітинним матриксом або основною речовиною.

Клітини у складі тканини виробляють компоненти позаклітинного матриксу, з якими потім можуть взаємодіяти. Крім того, клітини можуть взаємодіяти і з іншими частинами матриксу, що продукуються іншими типами клітин. Цей процес регулюється рецепторами клітинної поверхні, які включають специфічні внутрішньоклітинні шляхи передачі сигналу, що залежні від складу основної речовини і клітинних ультраструктур, якими вони представлені. У природі є безліч різновидів спеціалізованих поверхневих рецепторів. Сюди відносяться рецептори адгезії, селектини, інтегрини, імуноглобуліни й інші рецептори, що приймають участь в міжклітинних взаємодіях. Це, разом з дією внутрішньоклітинних сигнальних систем, може привести до модифікації поверхневих рецепторів, що в кінці кінців, призводить до зміни стосунків клітини з навколишнім середовищем (таблиця. 20.1).

Таблиця 20.1