Приборы для количественного учета пцр в режиме реального времени

-(REAL-TIME PCR)

Приборы для оценки ПЦР в режиме реального времени представляют собой своеобразный гибрид амплификатора и флюориметра и позволяют оценивать динамику ПЦР прямо в закрытых пробирках по мере накопления продукта ампли­фикации и проводить количественный ПЦР-анализ. Специфичность сигнала при ПЦР в реальном времени обусловлена применением специальных ДНК-зондов с флюоресцентной меткой. В процессе ПЦР по мере синтеза новых и новых копий искомого участка гена происходят специфическое связывание этой меченой цепочки нуклеотидов и ее разрушение с выходом красителя в окружающую среду. По мере протекания ПЦР светочувствительные элементы снимают показатели с каждой из пробирок и вводят эти данные в память компьютера. При этом строится динамическая кривая накопления ПЦР-продукта по отдельным пробам.

Объемы анализируемых проб, время анализа и температура измерений соот­ветствуют таковым для обычной ПЦР. Тем не менее в этом режиме не требуется дополнительное время на процедуры, связанные с электрофорезом, так как кри­вые накопления продуктов реакции доступны сразу по окончании real-time PCR. Калибровка зависит от типа имеющегося прибора. Она требуется для оптимизации параметров оптического блока и выравнивания показателей по отдельным лун­кам, осуществляется с теми флюорохромами, которыми помечены применяемые ДНК-зонды.

Количественная оценка ДНК или РНК патогенного микроорганизма в кли­нических образцах бывает исключительно важна для прогноза заболевания и контроля терапии. Эта технология активно внедряется в российские клинико-диагностические лаборатории.

Кроме возможности количественного учета результатов реакции, к несо­мненным достоинствам real-time PCR следует отнести высокую технологичность исследования и снижение вероятности загрязнения помещений лаборатории про­дуктами амплификации

Методы молекулярной клинической диагностики при скрининге (массовых обследованиях)

Уникальным преимуществом молекулярно-биологических методов является возможность динамического наблюдения за присутствием и содержанием опре­деленных генов, что позволило ввести их в соответствующие диагностические панели. Основным требованием на скрининговом этапе исследований является высокая чувствительность при достаточной специфичности диагностики. В част­ности, сочетанное применение иммунологических методов и ДНК-диагностики позволяет проводить серийные обследования на наличие гепатитов В, С и ВИЧ-1 в особых группах риска. На следующем этапе возможно повторное проведение диагностики уточняющего характера в отобранных во время скрининга группах с сомнительными или положительными результатами.

Применение пцр диагностики в гематологии и онкологии

Общеизвестно, что интенсивная цитостатическая терапия наряду с противоопу­холевым эффектом оказывает выраженное иммунодепрессивное действие. В связи с этим у больных необходимо регулярно контролировать наличие системных или локальных инфекций, прежде всего вирусной природы. Так, инфекция цитомегаловирусом или парвовирусом В19 может вызвать выраженное подавление гемопоэза. Вирус Эпштейна-Барр иногда сопутствует возникновению лимфом. Это осо­бенно важно при использовании препаратов, подавляющих иммунитет (например, циклоспорина) после пересадки костного мозга. Кроме того, после многократных трансфузий эритроцитов или тромбоцитов больных нужно периодически прове­рять на наличие вирусов гепатитов В и С в плазме крови.

Злокачественная трансформация клеток вызывается нарушениями в генах, отвечаю­щих за регуляцию их деления, дифференцировки и программированной гибели-апоптоза. Мутации генов - явление случайное, но селективный отбор мутантных клеток делает родоначальниками опухоли только те клетки, которые независимы от регуляторных сигналов организма. Для формирования злокачественности необходимо 6-14 генетических событий, хотя общее число мутаций в опухолевых клетках может состав­лять тысячи. Как правило, вся опухолевая масса является потомками одной клетки, по­этому и мутации передаются всем клеткам-потомкам.

Определение мутантных генов и их РНК продуктов составляет основу молекулярно-ге-нетической диагностики онкологических заболеваний. Молекулярно-генетические мето­ды онкодиагностики высокочувствительны (10^-15-10-¹⁸г). Полимеразная цепная реакция (ПЦР) мутантных генов в ДНК плазмы крови часто позволяет выявить опухоль в док­линической стадии. Теоретические расчеты показывают, что таким путем может быть обнаружен опухолевый очаг размером до 0,01 см³.

Наибольшую практическую ценность в качестве молекулярно-генетических маркеров име­ют онкогены и антионкогены. Онкогены - дефектные гены факторов положительной регу­ляции клеточного деления (семейства ras, raf и myc-генов, семейства генов ростовых рецеп­торов) и генов антиапоптозных факторов, особенно bcl-2. Антионкогены или гены супрессоры опухолевого роста - гены факторов отрицательной регуляции клеточного деления, или гены факторов апоптоза. Дефект антионкогенов приводит к потере их противоопухолевой функции. Хотя известны десятки генов супрессоров опухолевого роста, наибольшее диагно­стическое значение имеют мутации гена белка р53 — ингибитора клеточного деления и клю­чевого фактора апоптоза, которые встречаются более чем в половине случаев онкологиче­ских заболеваний. Почти столь же распространены в опухолях дефекты гена супрессора опу­холевого роста белка р16. Молекулярно-генетический анализ онкогенов myc, ras, bcl-2 и ан-тионкогенов р53, АРС и р16 позволяет выявить большинство опухолей человека. Ранним и постоянным признаком малигнизации является развитие состояния генетиче­ской нестабильности, что вызывает мутации в микросателлитных ДНК - второй вид мо­лекулярно-генетических онкомаркеров.

Наконец, для опухолей характерно нарушение метилирования ДНК. Поэтому тр. видом молекулярно-генетических маркеров может быть анализ сайтов метилирования в опухолевой ДНК. Наиболее характерно гиперметилирование генов р 16, HIC, 14-3-30, АРС, GSTP1, E-cad, hMLHl, PTEN.

Поскольку опухоли имеют обычно моноклоновую природу, маркерные мутации присут­ствуют во всех опухолевых клетках, что позволяет обнаружить достаточное количество молекул мутантной ДНК при анализе, как самой опухоли, так и лимфатических узлов, крови, костного мозга, содержащих опухолевые клетки. Более того, мутантные молеку­лы ДНК опухолевого происхождения могуг быть выявлены даже в плазме крови онколо­гических больных.

Таким образом, для диагностики опухолей могут быть использованы три вида молеку­лярно-генетических маркеров. Однако, если для анализа онкомаркеров в ткани опухоли достаточно невысокой чувствительности, обнаружение их в лимфоузлах, костном мозге, крови и особенно плазме крови дребует особо высокой чувствительности, которую надежно обеспечивает только ПЦР.

Фтизитатрия и пульмонология

Вопросы своевременной диагностики туберкулеза стали очень актуальны в последние годы в связи с ростом заболеваемости. Безусловно, «золотым стандартом ПЦР-Диагностику туберкулеза применяют в качестве подтверждающего метода выявления туберкулеза, особенно при внелегочной локализации очагов пораже­ния. Имеется значительный выбор коммерческих тест-систем для выявления ДНК Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis и комплексной диагностики этих видов. Использование ПЦР с детекцией результатов в реальном времени позво­ляет проводить высокочувствительное исследование, как в специализированном, так и в общелечебном учреждении уже на первичном этапе. Возможность количественной оценки позволяет своевременно делать заключение о степени эпидемической опасности пациента. Кроме того, исследование парных образцов или сравнение материала до и после начала курса лечения дает возмож­ность контролировать эффективность противотуберкулезной терапии.

В последние годы появились методы генной диагностики штаммов микобактерий, резистентных к противотуберкулезным препаратам. В частности, устойчивость палочки Коха к изониазиду или рифампицину связана с мутациями микробных генов. Для выявления «генов резистентности» необходимо вырастить чистую куль­туру туберкулезных бактерий от данного больного. Из бактерий выделяют ДНК и подвергают амплификации (в варианте мультиплексной ПЦР) с целью получить сегменты генов, которые могут содержать эти мутации. Затем эти продукты ПЦР дополнительно подвергают гибридизации на носителях (биочипах) с набором ДНК-зондов, специфичных к искомым мутациям. Положительный результат гибридиза­ции свидетельствует о наличии мутации, вызывающей устойчивость к определенно­му препарату, в связи с чем больному следует назначить другой препарат.

Выявление патогенных бактерий в мокроте, бронхоальвеолярном лаваже и других биологических материалах при неспецифических бронхолегочных забо­леваниях (бронхитах, пневмониях) обычно проводят стандартными бактериоло­гическими и иммунологическими методами. Однако при подозрении на вирусные инфекции можно и нужно проводить ПЦР-диагностику (например, на вирусы гриппа, парагриппа, респираторно-синцитиального вируса и др.). Особое значение имеет своевременная диагностика патогенных грибов, в частности рода Aspergillus, Candida, Mucor и др., у маленьких детей, пациентов пожилого возраста и больных с подавленным иммунитетом (например, после интенсивной цитостатической терапии при онкологических заболеваниях). Здесь методы ПЦР ДНК по скорости выполнения, точности и специфичности диагностики существенно превосходят обычные способы исследования, применяемые в микологии (микроскопию, куль­тивирование, определение специфических галактоманнанов в плазме крови и т.д.).