Добавил:
Upload Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
Учебник по КЛД 23.06.2014г.docx
Скачиваний:
2
Добавлен:
01.07.2025
Размер:
35.29 Mб
Скачать

Протокол исследования

ПЦР в диагностической лаборатории является достаточно сложной, многосту­пенчатой методикой, требующей правильного выполнения всех процедур. Ниже изложены основные специфические требования к процессам взятия образцов, выделения наследственного материала, выполнения амплификации и регистрации результатов, т.е. преаналитической, аналитической и постаналитической стадии исследования.

Взятие образцов

Клиническим материалом для исследования методом ПЦР могут служить соскобы эпителиальных клеток, кровь, плазма, сыворотка, плевральная и спин­номозговая жидкости, моча, мокрота, слизь и другие биологические выделения, биоптаты. Однако в большинстве анализов в качестве образца используют соскоб эпителиальных клеток и сыворотку крови пациента. К особенностям метода сле­дует отнести то, что материал, необходимый для исследования, должен потенци­ально содержать искомую ДНК (например, в абсолютном большинстве случаев невозможно детектировать в крови микроорганизм Chlamydia trachomatis, так как это внутриклеточный паразит эпителиальных клеток урогенитального тракта).

Выделение нуклеиновых кислот из биологического материала

В зависимости от поставленных задач используют различные методики для выделения нуклеиновых кислот из биологического материала. Суть методик заключается в экстракции из исследуемого образца нуклеиновых кислот и нейтра­лизации ингибиторов ПЦР.

В настоящее время существуют экспресс-методики выделения ДНК, позво­ляющие за сравнительно небольшое время обрабатывать много образцов с мини­мальными трудозатратами. Если перед лабораторией стоит задача получить более чистый препарат ДНК или детектировать низкокопийный образец, существуют методики, позволяющие провести очистку с высокой чистотой, но требующие больших трудозатрат.

Амплификация (умножение специфических фрагментов днк)

На данной стадии происходит накопление коротких специфических фрагментов ДНК в количестве, необходимом для их дальнейшей детекции.

Детекция результатов реакции

Регистрировать результат ПЦР можно либо по завершении реакции («по конечной точке»), либо на протяжении всей реакции (в реальном времени). Классическая ПЦР предполагает анализ результатов реакции по «конечной точке». Для этого используют методы электрофореза в геле, гибридизационно-ферментный анализ (ГИФА), флюоресцентную детекцию после ПЦР (FLASH) и др. Различные методы детекции результатов ПЦР имеют свои преимущества и недостатки, и, как правило, их выбирают в зависимости от задач, решаемых лабораторией. Для выявления количества ДНК в исходной пробе и наблюдения за кинетикой процес­са в современных лабораториях используют метод ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени.

Пцр с детекцией результатов в режиме реального времени

Метод ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени предусма­тривает автоматическую регистрацию увеличения флюоресцентного сигнала, пропорционального количеству синтезированных в ходе реакции специфических фрагментов ДНК (микроорганизмов, человека, животных и т.д.).

Реакция выполняется и автоматически регистрируется специализированными приборами для осуществления ПЦР в режиме реального времени. Программное обеспечение оборудования может автоматически переводить полученные данные в удобный для чтения врача-лаборанта формат.

В зависимости от исходной концентрации специфических нуклеиновых кислот (микроорганизмов, человека и т.д.) в исследуемом образце переход из стадии инициации в экспоненциальную стадию происходит на разных циклах. Чем больше в образце искомой ДНК, тем на более раннем цикле прибор начнет регистрировать флюоресценцию; чем меньше искомой ДНК, тем на более позднем цикле начнется автоматическая регистрация флюоресценции.

Метод ПЦР с детекцией результатов в процессе амплификации предоставля­ет возможность количественно оценивать ДНК микроорганизмов в исходном материале, а также использовать мультиплексный анализ (анализ результатов по нескольким каналам детекции), что дает возможность выявлять большее количе­ство микроорганизмов в каждой пробирке.

Преимущества методов молекулярной клинической диагностики

Основным преимуществом метода ПЦР при диагностике инфекционных аген­тов по сравнению с классическими микробиологическими методами (культивиро­ванием и идентификацией клинических изолятов) является быстрота исполнения (5-6 ч). В сравнении с иммунологическими определениями (например, иммуноферментными или иммунофлюоресцентными методами выявления антигенов).

ПЦР во многих случаях является более чувствительным и экономичным методом (по крайней мере, на отечественном рынке соответствующих реагентов). В частности, при диагностике вирусных инфекций, особенно гепатита С, вирусную РНК в плазме больных обнаруживают с первых дней заболевания, тогда как спе­цифические антитела (основной объект иммунологического скрининга при гепа­тите С) - только спустя 2-7 нед после заражения. При диагностике папилломы молекулярно-биологические методы позволяют дифференцировать онкогенные и менее патогенные типы вируса, а также идентифицировать вирус, интегрирован­ный в хромосомы человека, т.е. предраковые состояния.

При идентификации генетических заболеваний (инактивации белка из-за генной мутации) ДНК-диагностика стала более практичным методом выявления больных и членов семей - носителей мутантного гена по сравнению с биохими­ческими методами определения соответствующих метаболитов. Молекулярно-биологические методы особенно важны для диагностики наследственных заболева­ний, для которых неизвестен четкий биохимический субстрат или соответствующая биохимическая диагностика весьма дорога. Прогресс генной диагностики связан с успешным завершением проекта «Геном человека», в результате которого стала известна нормальная последовательность нуклеотидов в 99,9% генов человека. При подозрении на наличие редких мутаций гена проводят амплификацию и последующее секвенирование выделенного сегмента. Медико-генетические иссле­дования касаются в первую очередь наиболее распространенных генетических заболеваний - муковисцидоза, фенилкетонурии, миодистрофий.

При выявлении онкогенов, специфичных для различных злокачественных заболеваний, особенно лейкозов и лимфом, ПЦР-диагностика (при необходи­мости с последующим секвенированием продукта ПЦР) становится методом диагностики, превосходящим иммунохимические способы диагностики (иммуно-гистологические, проточно-флюориметрические) по чувствительности и часто по экономичности исследования.