Глава 8. Молекулярно-генетические исследования

Успехи молекулярной и клеточной биологии привели к возникновению молекулярной клинической диагностики. Эти исследования используются для лабораторной диагностики инфекций и многих пато­логических состояний человека путем детекции генных вариантов, присущих тому или иному виду организмов.

Молекулярную клиническую диагностику определяют в настоящее время как науку, занимающуюся выявлением патологий, изучением их причин и механизмов развития на молекулярном уровне. Преимущество такого подхода заключается в том, что он дает возможность выявить склонность к тому или иному заболеванию задолго до его клинических проявлений, вовремя принять профилактические меры, предотвратив его развитие или облегчив течение, и с учетом индивиду­альных особенностей применять терапию.

Используемые в лабораторных исследованиях современные молекулярные технологии представлены в таблице 8.1.

Таблица 8.1. Основные методы современных молекулярно-диагностических исследований

Тип технологии	Методы
Молекулярно-генетические методы для поиска новых генов или аллелей. Выявление мутаций	Секвенирование. Анализ конформационного полиморфизма одноцепочечной ДНК (SSCP). Гетеродуплексный анализ. Денатурирующий гель-электрофорез. Химическое/ферментативное расщепление некомплементар-ных оснований. Масс-спектрометрия. ДНК-чипы V
Молекулярно-генетические методы для выявления извест­ных генов или аллелей	Аллельспецифическая гибридизация/амплификация (ПЦР, LCR, NASBA). Капиллярный денатурирующий гель-электрофорез. Мини-секвенирование в твердой фазе. Олигонуклеотидлигазный анализ (0LA)
Геномные функциональ­ные методы для опреде­ления генной активности (экспр-есссия генов)	Экспрессионные РНК-чипы. Количественный РТ-ПЦР
Протеомные технологии	Двухмерный электрофорез. Многомерная хроматография. Масс-спектрометрия. Белковые чипы (SELDI). Мультиплексный анализ по технологии «Люминекс» («Биоплекс»)

Молекулярно-генетические исследования позволяют проводить:

• проводить диагностику инфекционных заболеваний по наличию или относительному содержанию специфических последовательностей ДНК/РНК патогенных микроорганизмов в биологических образцах;

• осуществлять дифференциальную генную диагностику злокачественных новообразований с неопухолевыми (предопухолевыми) поражениями, определять прогностически неблагоприятные генотипы лейкозов, выявлять минимальную остаточную болезнь и рецидивы злокачественных заболева­ний;

  • осуществлять своевременную диагностику генных мутаций и генных вариан­тов у больных и их родственников в целях медико-генетического консульти­рования, а также для идентификации личности и установления родства.

Генную диагностику используют при решении задач скрининга (профилактиче­ском обследовании), для установления (уточнения) диагноза, ранней диагностики заболеваний. На основе генной диагностики проводят:

• установление ориентировочного диагноза для выработки дальнейшей такти­ки обследования;

• обоснование и планирование специфической терапии;

• установление диагноза, включая исследование интраоперационного мате­риала (например, генотипирование Н. pylori в образцах слизистой оболочки желудка)

• раннюю диагностику заболеваний (в некоторых ситуациях - единственный возможный метод диагностики на начальном этапе болезни, в частности при ранней диагностике гепатита С). Это эффективный метод уточняющей диагностики, а во многих случаях - основной диагностический метод (например, в выявлении наследственных забо­леваний и прогнозе развития лейкозов).

В основе всех молекулярно-биологических методов лежит представление о том, что универсальным носителем генетической информации, исключая РНК-вирусы, является ДНК. ДНК представляет собой двойную цепь, скрученную в спираль. Каждая цепочка состоит из соединенных последовательно нуклеотидов (рис. 3-28). Нити ДНК имеют противоположную направленность: 5'-концу одной нити соответствует 3'-конец второй нитки. Уникальным свойством ДНК является ее способность удваиваться. В живой клетке этот процесс развивается следующим образом: с помощью специальных ферментов – гираз происходит расплетание спирали в том ее участке, где должна наблюдаться репликация. При этом водородные связи между азотистыми основаниями разрываются и нити расходятся. Одна из цепей (смысловая) используется в качестве основной матрицы. Построение новой нити ДНК идет только в одном направлении — от 5'-конца к 3'-концу. Данный процесс осуществляется по принципу комплементарности. Это строгое соответствие соеди­нения азотистых оснований, занимающих положение в двух цепях ДНК напротив друг друга и соединенных водородными связями, в котором: аденин соединяется с тимином (А-Т) и гуанин соединяется с цитозином (Г-Ц).

В настоящее время полимеразная цепная реакция (ПЦР) является наиболее распространенной и приемлемой в лабораторной медицине молекулярно-генетической методикой. ПЦР признается «золотым» стандартом для диагностики инфекционных возбудителей различной природы. Вследствие уникальной специфичности и чувствительности метода появилась возможность обнаруживать единичные молекулы ДНК возбудителей в исследуемом биоматериале.

Метод основан на обнаружении в исследуемом материале специфичных фрагментов ДНК (РНК) различных биологических объектов, их избирательном синтезе и дальнейшей детекции про­дуктов реакции амплификации - ампликонов. Для ПЦР характер­ны такие уникальные свойства, как высокая специфичность, чув­ствительность, универсальность и малое время для исследования.

Метод ПЦР позволяет специфично увеличивать (амплифицировать) количество исследуемого образца ДНК в десятки и сотни раз. Непосредственное определение специфического участка ДНК имеет ряд преимуществ по сравнению с традиционными методами диагностики.

Идея ПЦР основана на том. что фрагмент гена можно размно­жить в пробирке, увеличивая количество его копий в миллионы раз. Механизм ПЦР заключается в синтезе in vitro коротких нуклеотидных последовательностей для их анализа. Для проведения ПЦР нужны пара олигонуклеотидов (праймеров), комплементар­ных исследуемому фрагменту, и фермент ДНК-полимераза. В определенных условиях праймеры способны распознавать гомо­логичные последовательности в денатурированной ДНК, связы­ваться с ними и служить затравкой для ферментативного синтеза копий участка изучаемого гена. Каждый цикл синтеза удваивает число копий фрагмента-мишени, т. е. количество продукта (амплификата) в процессе ПЦР растет в геометрической прогрессии: 25-35 циклов реакции позволяют получить далее из единичного фрагмента ДНК достаточное количество амплификата для даль­нейшего изучения. В течение нескольких часов с помощью ПЦР из одного фрагмента молекулы ДНК можно получить более 50 млрд. идентичных молекул. Таким образом, можно изучить гене­тический материал, присутствующий в изучаемом образце в ми­нимальных количествах.

Теоретически метод ПЦР позволяет обнаружить даже одну копию ДНК в образце, не имея, таким образом, предела чувстви­тельности. Еще одно преимущество ПЦР заключается в том, что для этого метода характерна не только абсолютная чувствитель­ность, но и абсолютная специфичность. ПЦР не дает ложноположительных результатов при условии, что метод используется правильно. ПЦР-метод является не заменой традиционных мор­фологических, биохимических или иммунологических методик, но их существенным и необходимым дополнением.

В настоящее время в практическое здравоохранение внедряет­ся новая технология ПЦР - ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR). Ее особенностями являются мониторинг и количественный анализ накопления продуктов полимеразной цепной реакции, а также автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов. Этот метод не требует стадии электрофореза, что позволяет снизить требования, предъявляемые к ПЦР - лаборатории. За счет экономии производственных площадей, уменьшения количества персонала и востребованности количест­венного определения ДНК/РНК этот метод в последние годы ус­пешно применяется в крупнейших санитарно-эпидемических, диагностических и научно-исследовательских центрах развитых стран мира, замещая ПЦР в ее сегодняшнем («классическом») формате.

ПЦР в реальном времени использует флюоресцентномеченые олигонуклеотидные зонды для детекции ДНК в процессе ее ам­плификации. ПЦР в реальном времени позволяет провести пол­ный анализ пробы в течение 20-60 мин и теоретически способен детектировать даже одну молекулу ДНК или РНК в пробе.

ПЦР в реальном времени использует систему TaqMan контро­лирующую кинетику ПЦР непосредственно в ходе амплификации с использованием резонансного тушения флюоресценции. Для детекции используются зонд, несущий флюорофор и тушитель, комплементарный средней части амплифицируемого фрагмента. Когда флюорофор и тушитель связаны с олигонуклеотидным зондом, наблюдается лишь незначительная флюоресцентная эмиссия. В процессе амплификации за счет 5'-экзонуклеазной активности Taq-полимеразы флюоресцентная метка переходит в раствор, освобождаясь от соседства с тушителем, и генерирует флюоресцентный сигнал, усиливающийся в реальном времени пропорционально накоплению амплификата.

На сегодняшний день в теории и практике ПЦР накоплен бо­гатый опыт. Однако наряду с успехами, связанными с внедрени­ем ПЦР в клинико-диагностических лабораториях, нередко имеет место недоверие к этому методу из-за ошибок, приводящих к некорректным результатам. В основном такие ошибки возникают из-за контаминации ампликонами, которые попадают в окружающую среду на этапе детекции при переносе из пробирки в гель или планшет для гибридизационного анализа.

В связи с этим большой интерес прелставляют модификации метода ПЦР, по­зволяющие учитывать результаты реакции, не открывая пробир­ки. Одним из таких вариантов является метод «FLASH» (FLuorescent Amplification-based Specific Hybridization) - специ­фическая флюоресцентная гибридизация в процессе амплифика­ции.

В основе метода «FLASH» лежат три явления:

• эффект гашения флюоресценции;

• 5'-экзонуклеазная активность Taq-полимеразы;

• взаимодействие комплементарных фрагментов ДНК.

Следует отметить, что разработанная фирмой «ДНК"-Технология» система «FLASH» позволяет свести к мини­муму риск контаминации продуктами амплификации. Детекция результатов проводится в закрытых пробирках, что позволяет выполнять ПЦР - исследования в одной комнате и привлекать меньшее количество персонала. Кроме того, регистрация, интер­претация и хранение полученных результатов проводятся авто­матически.

ДНК-экспресс (НПФ «Литех»). Метод основан на термокоагуляционном кондиционировании ДНК. Полнота выделения ДНК из образца близка к 100 %. ДНК практически полностью остается в растворе, так как отсутствует разделение и перенос фаз. Наличие слизи, гноя, крови и прочих посторонних включе­ний практически не влияет на результат пробоподготовки. В слу­чае ингибирования ПЦР проба может быть подвергнута повтор­ной обработке без взятия материала у пациента. Защита от пере­крестной контаминации «от пробы к пробе» и возможной контаминации ампликонами достигается за счет того, что про­бирка в процессе обработки ни разу не открывается, в нее не до­бавляются посторонние компоненты. Пробоподготовка проходит в три стадии: вортексирование, нагрев, центрифугирование. При наличии одного термостата на 24 ячейки и одной центрифуги на 12 ячеек обработка 24 проб занимает всего 20 мин.

К преимуществам метода относятся простая и быстрая пробоподготовка, минимальный риск кросс-контаминации. Недостат­ком является достаточно ограниченный спектр биологического материала, пригодного для использования. Метод ДНК-экспресс предназначен для работы со следующим материалом: соскобы эпителиальных клеток, слюна, осадок мочи, сперма, секрет пред­стательной железы, спинномозговая жидкость, синовиальная жидкость. Однако ограниченная по времени сохранность материала является еще одним недостатком.

Уникальные диагностические возможности ИФА и ПЦР сде­лали их наиболее распространенным и в то же время постоянно развивающимися лабораторными методами в диагностике ин­фекций во всем мире. Однако их практическое применение тре­бует от врача определенного уровня знаний по иммунологии, молекулярной биологии и микробиологии. Так, при диагностике хронических, персистирующих инфекций, передаваемых поло­вым путем (ИППП) необходим комплексный подход - сочетание анализов на антитела сыворотки крови и локальных соскобов на ПЦР или антиген. Применение только соскобов допустимо лишь при остром или подостром воспалениях, но и тогда имеется риск получить ложноотрицательные результаты излеченности.

ПЦР выявляет самую стабильную, консервативную моле­кулу микроорганизмов - ДНК. Именно в уникальной последо­вательности нуклеотидов ДНК зашифрована наследственная ин­формация всех живых существ (геном некоторых вирусов содер­жит РНК). Специфичность ПЦР близка к 100 %, но в клинической практике ее чувствительность могут ограничивать некоторые факторы, поэтому исследователь может иногда полу­чить ложноотрицательные результаты. Прежде всего, отметим, что при хроническом воспалительном процессе макроорганизм ограничивает очаг воспаления клеточным барьером, а также кон­тролирует выход возбудителей постоянно циркулирующими IgG и IgA. При технически недоступной локализации очага для зонда-пробоотборника результат ПЦР будет ложноотрицательным. Также следует указать на целесообразность применения провока­ции перед использованием ПЦР. Обнаружение положительных результатов ПЦР в крови указывает на активизацию инфекции, вплоть до генерализации.