«Сухая» химия и экспресс-диагностика.

В настоящее время в клинической лабораторной диагностике, наряду с применением для определения физиологических и патологических компонентов мочи и крови методов «жидкой химии», все шире используются методология «сухой» химии. Они реализуются с применением специальных полосок, реагентные зоны которых содержат сухие реагенты, способные воздействовать на определенные метаболиты биологических жидкостей с изменением окраски индикаторной зоны.

Индикаторные тест-полоски применяются для полуколичественного и количественного определения диагностически значимых компонентов мочи, крови и других биосред. Их использование незаменимо для срочного анализа, (выполняемого в присутствии пациента в поликлинике, приёмном отделении, в больничной палате или дома, на месте лечения пациентов.

Необходимость быстрого получения объективной информации о жизнедеятельности организма возникает, в первую очередь, при критических состояниях, вызванных острой кровопотерей, шоком, сердечной, легочной или почечной недостаточностью, обширными ожогами, множественными травмами. В таких ситуациях результаты биохимических анализов непосредственно определяют конкретные действия врача. Кроме общепринятых клинических анализов крови и мочи проводят биохимические исследования.

Нарушения кислородного обеспечения, кислотно-основного состояния и электролитного баланса являются ведущими факторами в развитии тяжелых осложнений и необратимых состояний. Поэтому время от взятия анализа до получения конечных результатов врачом в таких случаях не должно превышать 5-7 минут. Экспресс-анализы необходимы в отделениях реанимации, интенсивной терапии и для этого используются автоматические полианализаторы, определяющие одновременно несколько показателей.

Возможность получить объективную информацию о состоянии пациента непосредственно на приеме врача существенно ускоряет процесс постановки клинического диагноза и назначения лечения. Такая необходимость может также возникнуть при диспансерных и профосмотрах на производстве, в экспедиционных условиях, в изолированных отдаленных местах проживания, на кораблях, в поездах дальнего следования, в спортивной медицине.

В настоящее время имеются большое количество специальных наборов и тест-полосок, позволяющих выполнить анализы в течение 3-10 минут в присутствии пациента. В основе их действия лежат биохимические (образование окрашенных продуктов реакции) и иммунологические (агрегация, агглютинация) методы. При этом не требуются какие-либо дополнительные реактивы или оборудование, так как оценка результатов проводится визуально с использованием эталонной шкалы, прилагающейся к набору тест-полосок.

Простота и быстрота процедуры определяют большую популярность и широкую распространенность экспресс-диагностики с использованием методов «сухой химии». Однако в ряде случаев результаты, полученные с их использованием, требуют подтверждения более объективными количественными методами. Наборы и тест-полоски имеют длительный срок хранения (1 год и более).

Ферменты

Ферменты (энзимы) - специфические белки, играющие роль биокатализаторов. Почти все они функционируют внутри тех клеток, в которых синтезируются, за исключением ферментов органов пищеварения и плазмы крови.

Успехи биохимии, физики и молекулярной биологии, связанные с разработкой высокочувствительных методов разделения белков, позволили установить существование в организме множественных форм ферментов, катализирующих одну и ту же реакцию. Для таких ферментов, предложено два термина - «изоферменты» и «множественные формы ферментов».

Термином «изоферменты» принято обозначать только те разновидности ферментов, у которых различия в первичной структуре определены генетически, т.е. их синтез контролируется разными генами. Примером может служить изоэнзимный спектр фермента лактатдегидрогеназы (ЛДГ). ЛДГ-цитозольный цинксодержащий фермент, который обратимо катализирует окисление лактата в пируват в цитоплазме клеток и сыворотке (плазме) крови - представлена 5 изоферментами.

Это количество обусловлено наличием двух генетических локусов, которые кодируют синтез двух олигомеров - субъединицы М (muscle) и субъединицы Н (heart). Соединяясь в тетрамеры, эти субъединицы образуют 5 изоформ, обозначаемых в соответствии с их подвижностью к аноду в электрическом поле: ЛДГ₁ (НННН), ЛДГ₂ (НННМ), ЛДГ₃ (ННММ), ЛДГ₄ (НМММ) и ЛДГ₅ (ММММ).

В соответствии с природой катализируемых энзимами реакций выделяют 6 основных классов ферментов:

1. Оксидоредуктазы, т.е. энзимы, катализирующие окислительно-восстановительные реакции. Представителями их являются лактатдегидрогеназа (ЛДГ), каталаза, глутаматдегидрогеназа.

2. Трансферазы, обеспечивающие реакции межмолекулярного переноса химических групп: аспартатаминотрансфераза (АСТ), аланинаминотрансфераза (АЛТ), гамма-глутамилтранспептидаза (ГГТП), креатинфосфокиназа (КФК) и др.

3. Гидролазы, катализирующие гидролитическое расщепление внутри-молекулярных связей: альфа-амилаза, липаза, холинэстераза (ХЭ), щелочная и кислая фосфатазы (ЩФ, КФ), лейцинаминопептидаза (ЛАП), пепсин, трипсин и др.

4. Лиазы, катализирующие разрыв и присоединение химических групп по месту локализации двойных связей: фруктозо-1-фосфат-альдолаза (Ф-1-Ф-А), фруктозо-1,6-дисфосфат-альдолаза (ФДФ-А) и др.

5. Изомеразы, обеспечивающие ферментативные реакции изомеризации.

6. Лигазы (синтетазы), ускоряющие реакции синтеза.

Все ферменты делят на универсально распространенные и органоспецифические. В печени содержатся, в основном, АЛТ, АСТ, ЛДГ, ЩФ; в сердечной мышце - КФК, ЛДГ, АСТ; в почках - ЛДГ, ЩФ, АСТ; в поджелудочной железе - альфа-амилаза, липаза, ЛДГ; в костной ткани - ЩФ; в предстательной железе - КФ.

Повышение активности ферментов в плазме (сыворотке) крови связано прежде всего с цитолизом (т.е. увеличением проницаемости плазматической мембраны, мембран лизосом, других органелл клеток, их некрозом) и выходом энзимов из поврежденных органов и тканей в кровеносное русло. При этом содержание и активность фермента в поврежденном органе снижается, а в плазме (сыворотке) крови - повышается. Следует учитывать, что благодаря общей реакции организма ферменты переходят в плазму не только из поврежденного органа, но также из клеток других органов и тканей, не затронутых патологическим процессом.

Для исследования активности ферментов чаще всего используется плазма или сыворотка крови. В процессе свертывания крови и последующей ретракции сгустка высвобождаются содержащиеся в тромбоцитах биологически активные вещества, под влиянием которых возрастает активность многих энзимов. Происходящее при этом разрушение форменных элементов крови, например, эритроцитов обуславливает дальнейшее увеличение ферментативной активности. Этим, в частности, объясняется известное предостережение не допускать гемолиза, например, при исследовании активности лактатдегидрогеназы крови.

Хранение сыворотки, как правило, сопровождается снижением активности ферментов. Для большинства из них активность не изменяется при комнатной температуре в течение 6-8 часов, около недели - при 4˚С и на протяжении одного месяца - в замороженном состоянии.

Следует учитывать, что многие антикоагулянты способны ингибировать (иногда, напротив, усиливать) активность ферментов. Известно, например, что оксалаты подавляют активность ЛДГ, в то время как салицилаты повышают активность аминотрансфераз.

Используемые в клинико-диагностических лабораториях методы определения активности ферментов могут быть разделены на две основные группы:

а) состоящие из определения конечного продукта, образовавшегося после известного периода инкубации ферментного препарата (обычно сыворотки) с субстратом в соответствующем буфере (метод конечной точки, выполняемый путем измерения опытной и контрольной проб, т.е., по сути, измерение проводится в двух точках). Для этого используется специальная химическая реакция, а учет оптической плотности может быть произведен на ФЭКе (колометрические методы) и биохимических анализаторах;

б) методы, с помощью которых в ходе ферментативной реакции непрерывно или периодически определяют потребление субстрата, кофермента либо образование метаболита. Методы этой группы называются кинетическими, или методами непрерывной регистрации.

Активность ферментов выражается количеством разрушенного субстрата или образованного в ходе реакции продукта (моль, ммоль, мкмоль и т.д.) в пересчете на один литр сыворотки (плазмы) крови при температуре 37, 30, 25˚С либо в международных единицах (МЕ/л, U/L), а также в каталах (долях катала) на литр, например мккат/л (1 мккат = 60 U; 1 U = 16,67 ·10^-3 мккат). Одна единица (U) какого-либо энзима - есть то его количество, которое катализирует трансформацию 1 мкмоль субстрата за 1 мин при оптимальных условиях.