1.4. Структурная организация белков

Доказано существование 4 уровней структурной организации белковой молекулы.

Первичная структура белка – последовательность расположения аминокислотных остатков в полипептидной цепи. В белках отдельные аминокислоты связаны друг с другом пептидными связями, возникающими при взаимодействии -карбоксильных и -аминогрупп аминокислот:

.

К настоящему времени расшифрована первичная структура десятков тысяч разных белков. Для определения первичной структуры белка методами гидролиза выясняют аминокислотный состав. Затем определяют химическую природу концевых аминокислот. Следующий этап - определение последовательности аминокислот в полипептидной цепи. Для этого используют избирательный частичный (химический и ферментативный) гидролиз.

Методы определения n-концевой аминокислоты

Метод Сэнджера, основанный на реакции с 2,4-динитрофторбензолом (ДНФБ). Образуется окрашенное в желтый цвет 2,4-динитрофенильное производное N-концевой аминокислоты, которую идентифицируют хроматографически.

Фенилтиогидантоиновый метод Эдмана. Фенилизотиоцианат реагирует со свободной -аминогруппой N-концевой аминокислоты полипептида. Природу фенилтиогидантоина N-концевой аминокислоты устанавливают хроматографически, а укороченный на одну аминокислоту полипептиданализируют далее. Метод Эдмана осуществляют в специальном приборе - секвенаторе (от англ. sequence – последовательность).

Методы определения с-концевой аминокислоты

Ферментативные методы. Обработка полипептида карбоксипептидазой приводит к освобождению С-концевой аминокислоты, которуюустанавливают методом хроматографии.

Химический метод Акабори. Гидразин, вызывая распад пептидных связей, реагирует со всеми аминокислотами, за исключением С-концевой.

Следующий этап - определение последовательности аминокислот в полипептидной цепи. Проводят частичный гидролиз полипептидной цепи на короткие пептидные фрагменты. Избирательно гидролизующие вещества: цианогенбромид CNBr (по остаткам мет), гидроксиламин (по связям между остатками асп и гли), N-бромсукцинамид (по остаткам три). Пепсин ускоряет гидролиз связей, образованных остатками фен, тир и глу, трипсин - арг и лиз, химотрипсин - три, тир и фен.

Возможно применение рентгеноструктурного анализа, а также данных о комплементарной нуклеотидной последовательности ДНК.

Вторичная структура белка – конфигурация полипептидной цепи, т.е. способ упаковки полипептидной цепи в определенную конформацию (рис. 1). Процесс этот протекает не хаотично, а в соответствии с первичной структурой белка.

а	б
Рис. 1. Вторичная структура белка: а - -спираль, б - -структура

Стабильность вторичной структуры обеспечивается в основном водородными связями, однако определенный вклад вносят ковалентные связи – пептидные и дисульфидные.

Наиболее вероятным типом строения глобулярных белков считают -спираль. Закручивание полипептидной цепи происходит по часовой стрелке. Для каждого белка характерна определенная степень спирализации. Если цепи гемоглобина спирализованы на 75%, то пепсина - всего на 30%.

Тип конфигурации полипептидных цепей, обнаруженных в белках волос, шелка, мышц, получил название -структуры. Сегменты пептидной цепи располагаются в один слой, образуя фигуру, подобную листу, сложенному в гармошку. Слой может быть образован двумя или большим количеством пептидных цепей.

Способность к образованию водородных связей, являющихся движущей силой при возникновении α- и β-структур в белковой молекуле, присуща разным аминокислотам в неодинаковой степени. Выделяют группу спиралеобразующих аминокислот: ала, глу, глн, лей, лиз, мет и гис. Вал, иле, тре, тир и фен способствуют образованию -слоев полипептидной цепи. Гли, сер, асп, асн и про имеют отношение к преимущественному возникновению неупорядоченных фрагментов в ее составе.

В природе существуют белки, строение которых не соответствует ни β-, ни -структуре (коллаген).

Третичная структура белка – пространственная ориентация полипептидной спирали или способ укладки полипептидной цепи в определенном объеме. Первый белок, третичная структура которого была выяснена рентгеноструктурным анализом - миоглобин кашалота (рис. 2).

В стабилизации пространственной структуры белков, помимо ковалентных связей, основную роль играют нековалентные связи (водородные, электростатические взаимодействия заряженных групп, межмолекулярные ван-дер-ваальсовы силы, гидрофобные взаимодействия и т.д.).

Методами рентгеноструктурного анализа доказано существование уровней структурной организации белковой молекулы, промежуточных между вторичной и третичной структурами. Домен - это компактная глобулярная структурная единица внутри полипептидной цепи (рис. 3). Открыто много белков (в частности, иммуноглобулины), состоящих из разных по структуре и функциям доменов, кодируемых разными генами.

Рис. 2. Третичная структура миоглобина	Рис. 3. Глобулярные домены в g-кристаллине (белке хрусталика глаза человека)

По современным представлениям, третичная структура белка после завершения его синтеза формируется самопроизвольно. Основной движущей силой является взаимодействие радикалов аминокислот с молекулами воды. При этом неполярные гидрофобные радикалы аминокислот погружаются внутрь белковой молекулы, а полярные радикалы ориентируются в сторону воды.

Процесс формирования нативной пространственной структуры полипептидной цепи - фолдинг. Из клеток выделены белки, названные шаперонами. Они участвуют в фолдинге (рис. 4). Описан ряд наследственных заболеваний человека, развитие которых связывают с нарушением вследствие мутаций процесса фолдинга (пигментозы, фиброзы и др.).

Рис. 4. Участие шаперонов в фолдинге белков

Все биологические свойства белков связаны с сохранностью их третичной структуры, называемой нативной. Белковая глобула не является абсолютно жесткой: возможны обратимые перемещения частей полипептидной цепи. Эти изменения не нарушают общей конформации молекулы. На конформацию молекулы белка оказывают влияние рН среды, ионная сила раствора, взаимодействие с другими веществами. Любые воздействия, приводящие к нарушению нативной структуры молекулы, сопровождаются частичной или полной потерей белком его биологических свойств.

Четвертичная структура белка - укладка отдельных полипептидных цепей, обладающих первичной, вторичной или третичной структурой, в пространстве, и формирование единого макромолекулярного образования.

Белковую молекулу, состоящую из нескольких полипептидных цепей, называют олигомером, а каждую входящую в него цепь - протомером. Олигомерные белки чаще построены из четного числа протомеров, например, молекула гемоглобина состоит из двух - и двух -полипептидных цепей (рис. 5).

Рис. 5. Молекула гемоглобина

Четвертичной структурой обладает около 5% белков, в том числе гемоглобин, иммуноглобулины. Субъединичное строение свойственно многим ферментам, в первую очередь тем, которые выполняют сложные функции. Почти все ДНК- и РНК-полимеразы имеют четвертичную структуру. Белковые молекулы, входящие в состав белка с четвертичной структурой, образуются на рибосомах по отдельности и лишь после окончания синтеза формируют общую надмолекулярную структуру. Биологическую активность белок приобретает только при объединении входящих в его состав протомеров. В стабилизации четвертичной структуры принимают участие те же типы взаимодействий, что и в стабилизации третичной.

Некоторые исследователи признают существование пятого уровня структурной организации белков. Это метаболоны - полифункциональные макромолекулярные комплексы разных ферментов, катализирующих весь путь превращений субстрата (синтетазы высших жирных кислот, пируватдегидрогеназный комплекс, дыхательная цепь).

Белок, выполняющий определенную функцию в живой клетке, может быть представлен несколькими формами - изофункциональными белками, или изобелками. Так, в эритроцитах человека обнаружено несколько форм гемоглобина: HbF характерен для эмбриональной стадии развития человека (фетальный гемоглобин), у взрослого человека преобладают НbА. Все формы гемоглобинов выполняют функцию переноса кислорода из легких в ткани, однако свойства разных гемоглобинов отличаются.