4. Бактеріофаг, його природа і практичне застосування. Вплив бактеріофага на мінливість мікроорганізмів

Бактеріофаги — це віруси, які паразитують на бактеріях і здатні спричинювати їх лізис.

Явище бактеріофагії, тобто лізису бактерій фагами, спостеріга­ли багато вчених (В.А. Хавкін, М.Ф. Гамалія та ін.), але пріоритет у відкритті бактеріофага (1917) нале­жить канадському вченому Феліксу д'Ереллю, який працював в Інституті Пастера у Парижі.

Вивчаючи дизентерію, він замис­лився над тим, чому на початку захво­рювання збудник хвороби висіваєть­ся з випорожнень хворого у великій кількості, а наприкінці захворювання— не висівається. Він запідозрив появу якогось агента, який знищував збудника дизентерії. Щоб виявити його, Ф. д'Ерелль кожного дня вно­сив у пробірки із засіяною культурою збудників дизентерії фільтрат випо­рожнень хворого. Після інкубації в термостаті культура виростала. Але коли хворий почав одужувати, культура збудників дизентерії під впливом фільтрату випорожнень розчинилася, при чому лізуюча здатність фільтрату випорожнень посилювалася під час послідовних пасажів на свіжих культурах бакте­рій. З цього вчений зробив висновок, що лізис бактерій спричинює живий агент, здатний проникати через бактеріальний фільтр, тобто вірус. Д'Ерелль назвав його Васteriophagum intestinale, що означає: той, що поїдає бактерії і виділений з кишечнику.

Пізніше були відкриті віруси, здатні руйнувати клітини синьо-зелених водоростей, актиноміцетів. Тому цю групу вірусів стали на­зивати фагами.

За своєю природою це живі організми. Вони здатні розмножу­ватися, змінюватися під впливом факторів навколишнього серед­овища, адаптуватися до інших видів мікробів, передавати у спадок свої властивості. Фаги інфікують і руйнують тільки молоді клітини мікроорганізмів, вони є облігатними внутрішньоклітинними пара­зитами мікробних клітин.

Як в усіх вірусів, віріони фагів складаються з білкової оболон­ки — капсиду і нуклеїнової кислоти. У більшості фагів розрізняють головку і хвостовий відросток. У деяких фагів відрос­ток дуже короткий або взагалі відсутній. За формою фаги бувають: ниткоподібні, сферичні та сперматозоїдні. За розміром — дрібні, се­реднього розміру і великі. Розмір фагової часточки коливається від 20 до 200 нм. Діаметр головки в середньому становить 60—100 нм, довжина відростка — 100—200 нм. Нуклеїнова кислота може бути представлена РНК, одно- та двонитковою ДНК. Найбільше ви­вчені Т-фаги. Вони утворюють Т-групу колі-дизентерійних фагів: непарні -Т₁,Т₃,Т₅,Т₇ і парні-Т₂,Т₄, т_б.

Найбільш складну структуру мають Т-парні фаги, а конкретно саме Т₂.

У фага Т₂ капсид головки шести­гранної форми, капсомери в ній роз­міщені за кубічним типом симетрії. Капсид чохла відростка має цилін­дричну форму, капсомери в ньому розміщені за спіральним типом си­метрії. На кінці відростка є шести­кутна базальна пластинка, в кутах якої розміщені зубці і фібрили. У го­ловці фага міститься двониткова суперспіралізована ДНК, на вільному кінці відростка — фермент лізоцим.

Фаги більш стійкі до фізичних і хімічних факторів навколиш­нього середовища, ніж вегетативні форми бактерій, у яких вони розмножуються. Фаги витримують нагрівання до 75 °С, заморожу­вання, висушування, коливання рН від 5,0 до 8,5, не чутливі до антибіотиків, хлороформу, фенолу, розчинів гліцерину й етилового спирту. Ці фактори використовують для виділення фагів. На фаги згубно діють кислоти, формалін, ультрафіолетове та іонізуюче раді­аційне випромінювання.

Зберігають фаги у запаяних ампулах у рідкому і ліофілізованому стані протягом 5—6 і навіть 13 років за температури 6±4 °С у місці, захищеному від світла.

Фаги здатні розмножуватися в клітинах певного виду бактерій, що зумовлено наявністю рецепторів у фагів і на оболонці відповід­них мікробних клітин. Тому в основу номенклатури фагів покладе­на видова назва мікроба-хазяїна: дизентерійні фаги, стафілококові, сальмонельозні, дифтерійні та ін.

За специфічністю розрізняють: видові фаги, які паразитують у клітинах тільки одного виду бактерій (холерний, дифтерійний); по­лівалентні, що паразитують у клітинах близьких видів бактерій, які належать до одного роду (полівалентний дизентерійний фаг); типові, які паразитують у клітинах окремих варіантів одного виду мікроорганізмів (стафілококові, черевнотифозні). Типові фаги називають літерами латинського ал­фавіту або цифрами. За допомогою типових фагів проводять найбільш детальну диференціацію бактерій всередині одного виду, поділяючи їх на фаговаріанти, що має важливе діагностичне й епідеміологічне зна­чення.

Розрізняють фаги інфекційні — здатні проникати у мікробну кліти­ну, і неінфекційні, або незрілі, — це фаги, що перебувають у стадії роз­множення.

Інфекційні фаги, в свою чергу, поділяють на вірулентні — здат­ні репродукуватися в мікробній клітині і спричинювати її лізис, і помірні — здатні проникати в мі­кробну клітину й інтегрувати в її геном. Поза живою клітиною фаги перебувають у стадії спокою.

Життєвий цикл фага може про­являтися у формі продуктивної, редуктивної й абортивної інфекції.

Продуктивну інфекцію спричи­нюють вірулентні фаги. При цьому життєвий цикл фага складається з 6 послідовних стадій (мал. 14): І —адсорбція на поверхні чутли­вої клітини за допомогою хвосто­вого відростка. Вона відбувається, якщо фагові рецептори відповіда­ють рецепторам клітинної стінки

бактерій; на протопластах (клітинах, що повністю втратили клітинну стінку) фаги не адсорбуються. На адсорбцію фага впливають хімічний склад середовища, рН, температура;

II — проникнення нуклеїнової кислоти фага в бактеріальну клітину (оболонка фага залишається поза клітиною і називається "тінню" фага);

III — реплікація фагової нуклеїнової кислоти;

IV   — синтез білкової оболонки фага і фагоспецифічних фермен­тів;

V— формування нових часточок фагів;

VI— вихід сформованих фагів із клітини відбувається за раху­нок лізису із середини вільним лізоцимом — шлях "вибуху".

Деякі ДНК-геномні фаги вивільняються із клітини шляхом "просочування" через цитоплазматичну мембрану і клітинну стінку, під час якого утворюється їхній капсид. Бактеріальна клітина при цьому залишається життєздатною.

З однієї фагової часточки синтезується 200—300 нових фа­гів. Цикл репродукції фагів відбувається дуже швидко. Вже через 13 хв після проникнення фага в чутливу клітину з'являються нові віріони.

Якщо на клітині адсорбується велика кількість фагових віріонів, то може відбутися лізис і ззовні. Репродукція фага при цьому не відбувається.

Редуктивну інфекцію спричинюють тільки помірні фаги. У цьому разі життєвий цикл фага складається з таких стадій:

I — адсорбція фага на поверхні чутливої клітини;

II  — проникнення фагової нуклеїнової кислоти в бактеріальну клітину;

III—інтеграція фагової нуклеїнової кислоти в хромосому клітини — фагова нуклеїнова кислота стає складовою частиною геному клітини-хазяїна, утворюючи єдину хромосому, і називається профагом.

Явище симбіозу профага і бактеріальної клітини називається лізогенією, а культура мікроорганізмів, що містить профаг, — лізогенною. Ця назва відображає потенційну здатність лізогенних клітин до лізису у разі вивільнення профага із складу бактеріаль­ного геному і перетворення його на вірулентний фаг. Лізогенна клітина не гине, вона розмножується, а профаг передається у спа­док її дочірнім клітинам. Разом із профагом бактеріальна клітина може отримати гени, що несуть інформацію про будь-які власти­вості (наприклад, іох-ген надає мікробній клітині властивість про­дукувати екзотоксин — збудник дифтерії). Таку форму мінливості називають лізогенною, або фаговою, конверсією, а здатність фага переносити гени— трансдукцією.

Виходу профага із хромосоми клітини заважає білок-репресор, синтез якого контролюється фагом. Лізогенна культура набуває імунітету щодо проникнення в неї інших часточок цього фага. У разі дії на лізогенну культуру суббактерицидних доз рентгенівського, ультрафіолетового, космічного випромінювань, хімічних речовин та інших факторів, що інактивують білок-репресор, профаг може вийти із хромосоми, перетворитися на вірулентний фаг і спричинити продуктивну інфекцію — лізис бактеріальної клітини. Помірні фаги можуть бути дефектними, тобто не здатними давати фагове потомство. Такі фаги використовують для трансдукції в генній інженерії.

При абортивній інфекції взаємодія фага з мікробною клітиною переривається на будь-якій стадії його життєвого циклу і він гине.

Фаги дуже поширені у природі. їх виявляють в організмах людей, тварин і їх випорожненнях, у воді річок і морів; особливо багато їх у стічних водах, де є відповідні бактерії, у ґрунті, повітрі, музейних культурах. Фаги виділяли із тканин пухлин, що утворюються на рослинах, із овочів, фруктів, молока.

Джерелом фагів проти патогенних мікробів є хворі люди і твари­ни, носії і реконвалесценти, об'єкти навколишнього середовища. У людей фаги виділяли з випорожнень, сечі, крові, мокротиння, сли­ни, гною, виділень із носа.

Виділення фагів патогенних мікробів із ґрунту, води вказує на те, що в цій місцевості є хворі люди чи тварини, які їх виділяють у довкілля. Виявляють фаги в об'єктах навколишнього середовища за допомогою реакції наростання титру специфічного фага (РНТФ).

Добувають фаги із фільтрату матеріалу, що досліджується, або із бульйонної культури мікроорганізмів, до якої додають виробничий фаг і інкубують за температури 37 °С протягом 1 доби. За цей час кількість фагових часточок різко збільшується. Потім цю культуру фільтрують через бактеріальний фільтр. Фільтрат перевіряють на чистоту, стерильність, нешкідливість і активність фага.

Наявність вірулентного фага виявляють за його здатністю спри­чинювати лізис тест-культури. Методи виявлення фагів бувають якісні і кількісні.

Якісне виявлення фагів проводять на щільному поживному середовищі, засіяному тест-культурою. Фаг спричинює появу стерильних (прозорих) плям у тому місці, де був нанесений специфічний фаг. Ці стерильні плями називають негативними колоніями фага. У рідкому поживному середовищі вірулентий фаг зумовлює відсутність росту культури (бульйон залишається прозорим) або розчинення культури (просвітління бульйонної культури мікроорганізмів).

Кількісне визначення фага (визначення його активності) прово­дять за методами Аппельмана або Граціа. Титр фага за Аппельма-ном — це найбільше його розведення (або найменша концентрація), при якому фаг пригнічує ріст тест-культури в умовах досліду. Титр позначають цифрою, що вказує на ступінь розведення фага. Найчас­тіше використовують фаг у титрі 10~4.

Титр фага за Граціа — це кількість часточок фага в 1 см³ матеріалу, що досліджується (наприклад, 32 • 10⁷).

Враховуючи літичну дію фагів на бактерії, їх використовують для лікування різних хвороб травного тракту, запальних хвороб носа, ротової порожнини, верхніх дихальних шляхів, сечостатевої системи, холециститів тощо.

Фаги не токсичні, не мають протипоказань до застосування, побічні реакції не зареєстровані. Їх можна використовувати разом із будь-якими іншими лікувальними препаратами, в тому числі й антибіотиками. Можна призначати вагітним жінкам, дітям будь-якого віку, навіть недоношеним. Це дає змогу використовувати фаги не тільки для лікування, а й для профілактики інфекційних захворювань.

Основною умовою успішного використання фага для лікування і профілактики хвороб є перевірка виділеної культури на чутливість до відповідного фага. Препарати фага призначають перорально при захворюваннях внутрішніх органів; у вигляді високої клізми, введення в пазухи та порожнини носа, середнього вуха, черевну, плевральну, сечового міхура, матки, піхви, абсцесу або місцево для оброблення гнійних ран у вигляді зрошування. Дія фага проявляєть­ся через 2—4 год після введення. Фаги легко проникають у кров, лімфу, виводяться через нирки і санують сечові шляхи. Найбільше практичне значення для лікування і профілактики мають бактеріофаги: колі-протейний, сальмонельозний, полівалентний дизентерійний, стафілококовий, стрептококовий, полівалентний бактеріофаг клебсієл. Препарати цих фагів випускають у рідкому стані, в таблетках з кислотостійким покриттям, у формі свічок. Вони зберігаються за температури 2—10 °С у сухому, захищеному від світла місці. Після закінчення терміну придатності використання їх неприпустиме.

Фаги використовують для діагностики інфекційних хвороб з ме­тою ідентифікації культури (холерний, чумний фаги).

Фаготипування дає змогу визначити фаговаріант культури, а відтак, встановити джерело інфекції.

За допомогою тест-культури визначають вид невідомого фага, а за реакцією РНТФ— санітарно-епідемічний стан довкілля без ви­ділення культури збудника.

Бактеріофаги непатогенних ешерихій (коліфаги) використову­ють як найбільш ефективний індикатор вірусного забруднення водних об'єктів.

Помірний фаг використовують у науково-дослідних роботах як фактор мінливості мікроорганізмів, а також для вирішення проблем молекулярної біології, вивчення генетичного коду, росту зло­якісних пухлин, в генній інженерії.

Лізогенні культури більш чутливі до радіації, ніж "здорові", тому їх використовують як детектори радіації. В космічні апарати вміщують лізогенну культуру для контролю надійності захисту від космічного випромінювання: у разі проникнення випромінювання в апарат помірний фаг перетворюється на вірулентний і лізує культу­ру, при цьому мутна бульйонна культура бактерій стає прозорою.