2. Мембранний потенціал спокою

Мембрана клітини електрично поляризована, і різницю потенціалів між зовнішньою і внутрішньою пластинками (поверхнями) клітинної мембрани називають мембранним потенціалом спокою (МПС). Для того щоб зрозуміти природу виникнення цього потенціалу, треба розглянути деякі властивості самої мембрани, а також склад поза- і внутрішньоклітинної рідин.

Клітинна мембрана має значний опір і ємність. Так, у аксона кальмара питомий опір клітинної мембрани (R_м) становить у стані спокою 1000 Ом • см², а ємність (С_м) — приблизно 1 мкФ/см². Ємність мембрани, яка створюється переважно її ліпідним матриксом, є досить сталою, а опір значною мірою залежить від стану її йонних каналів.

Існування МПС зумовлене передусім нерівномірною концентрацією іонів у поза- та внутрішньоклітинному просторі.

Другим важливим чинником, який має значення для створення МПС, є різна проникливість клітинної мембрани для різних іонів. Клітинна мембрана легко проникна для жиророзчинних речовин, молекули яких проходять крізь її ліпідний матрикс. Водорозчинні молекули великого діаметра, у тому числі й аніони органічних кислот, практично не проникають крізь мембрану У стані фізіологічного спокою клітинна мембрана є проникною лише для К⁺, оскільки в ній є спеціальні калієві канали, що пропускають лише гідратований калій.

Коли К⁺ виходить з клітини, він затримується на зовнішній поверхні клітинної мембрани, створюючи її позитивний заряд. Великі аніони не можуть пройти з клітини скрізь мембрану і накопичуються біля її внутрішньої поверхні, створюючи негативний потенціал. Так виникає трансмембранна різниця потенціалів, або МПС.

Цей потенціал протидіє подальшому виходу К⁺ за електрохімічним градієнтом.

Переміщення К⁺ із клітини назовні зумовлюється його концентраційним градієнтом, який здійснює осмотичну роботу.

Унаслідок МПС К⁺ частково повертається назад у клітину. При цьому здійснюється електрична робота.

.

Мал. 1. Будова клітинної мембрани (о), її еквівалентна електрична схема (е) і схема активного перенесення йонів за рахунок енергії АТФ (б): / — іонний насос; 2 — ліпідний матрикс (білкові молекули, то утворюють іонні канали і насос, заштриховані); горизон­тальними стрілками показано ворітні механізми, вертикаль­ними — напрямок руху іонів; Е_Nа, Е_К, Е_нас — потенціал натрію, калію, насоса; R_м, С_м — опір та ємність клітинної мембрани

Якщо вихід К⁺ з клітини переважає над надходженням, то поступово зростає А_елі дещо зменшується а_осм. Внаслідок цього на клітинній мембрані виникає потенціал Е, за якого А_ел=а_осм для К⁺ і який називають калієвим рівноважним потенціалом (Е_К).

Різницю між поточним значенням МПС і Е_к називають електрохімічним градієнтом для К_К. Він є основною причиною пасивного руху К⁺ крізь мембрану в природних умовах.

Якщо відношення внутрішньої і зовнішньої концентрації іонів калію становить, наприклад, 39, а температура середовища + 20˚ С то Е_к становитиме 0,092 В.

За такого значення Е_к різниця концентрацій К⁺ між внутрішнім і зовнішнім середовищами клітини залишається практично незмінною, незважаючи на високу проникливість клітинної мембрани до К⁺, оскільки підтримується постійною роботою натрій-калієвого насоса.

Слід зауважити, що на підтримання МПС витрачається дуже мало К⁺, основна їх частина повинна забезпечувати електронейтральність внутрішнього середовища клітини. Адже внутрішньоклітинні аніони – це переважно великі білкові молекули, які не можуть пройти крізь клітинну мембрану, і тому їх концентрація залишається сталою. Ці великі аніони мають бути зрівноважені відповідною кількістю катіонів. У зв'язку з тим, що вміст Nа⁺ всередині клітини дуже незначний, цю функцію виконують К⁺. Тому внутрішньоклітинна концентрація К⁺ має бути такою ж високою, як і концентрація великих аніонів, і такою ж стабільною.

МПС створює електричне поле значної напруги — 10⁵ В/см². Це поле діє на макромолекули мембрани й надає їхнім зарядженим групам певної просторової орієнтації. Крім того, дуже важливо, що електричне поле МПС забезпечує функцію іонних каналів клітинної мембран.

У стані спокою клітинна мембрана є добре проникною не лише для К⁺, вона певною мірою проникна також для інших іонів, зокрема Nа⁺, С1^–, Са²⁺. Потоки цих іонів порушують рівноважний стан. Тої факт, що в умовах спокою Nа⁺ постійні надходить у клітину, а К⁺ виходить з неї, має дуже важливі наслідки, оскільки система не може бути фактично врівноважена, за допомогою звичайної дифузії і простого відновлення заряду на клітинній мембрані. Якщо немає інших процесів, то клітина дуже швидко накопичуватиме Nа⁺, втрачатиме К⁺, що зменшить їх трансмембранний градієнт. Отже, цей процес може призвести до різкого зниження МПС і загибелі клітини. Проте такого не відбувається, оскільки цьому протидіє натрій-калієвий насос.

Оскільки Nа⁺ сам не може вийти з клітини, а К⁺ — надійти в клітину проти своїх електрохімічних градієнтів, вони повинні активно переміщуватися крізь мембрану і на забезпечення цього транспорту має витрачатися енергія. Такий механізм дістав назву натрій-калієвого насоса. Він працює, споживаючи енергію АТФ, і його основним компонентом є фермент мембранна натрій-калій-АТФ-аза. У нормі АТФ потрапляє до насоса з мітохондрій аксоплазми. Для роботи насоса обов'язково мають бути зовні К⁺, а всередині — Nа⁺.

Енергія розщеплення однієї молекулі АТФ забезпечує виведення з клітині трьох іонів натрію і введення всередині клітини двох іонів калію. Це означає, що натрій-калієвий насос є електрогенним: він створює на клітинній мембрані додаткову різницю потенціалів Е_нас, яка додається до рівня МПС.

Цей електрогенний додаток до нормального рівня МПС неоднаковий для різних клітин. Зазвичай у нервових клітин хребетних він незначний, а в гігантських нейронах молюсків і гладком'язових клітинах може становити до 25 % значенні МПС.

Отже, у формувати МПС натрій-каліевий насос виконує дві функції: 1) підтримує трансмембранний градієнт концентрацій Nа⁺ і К⁺; 2) генерує певну різницю потенціалів, яка додається до потенціалу що створюється дифузією К⁺ за концентраційним градієнтом.

Важливим показником здатності іонів проходити крізь клітинну мембрану є її проникність. Значення проникності для іонів К⁺,Nа⁺ і Сl^– (Р_К Р_Nа, Р_Сl) можна використовувати для обчислення МПС мембрани, проникної для всіх цих іонів, за рівнянням Гольдмана — Ходжкіна— Катца (рівняння постійного поля).

ПОТЕНЦІАЛ ДІЇ

Потенціалом дії (ПД) називають швидке коливання МПС, що виникає під час збудження клітини. В основі ПД лежать зміни електричної (іонної) провідності клітинної мембрани. Амплітуда і тривалість ПД окремої клітини мало залежать від сили подразнення, важливо лише, щоб ця сила досягла певного критичного значення — порогової сили подразнення. ПД, що виникає у місті подразнення, поширюється вздовж нервового чи м'язового волокна, не змінюючи своєї амплітуди. Наявність порогу подразнення і незалежність амплітуди ПД від сили подразнення підпорядковуються закону "все або нічого".

Для реєстрації ПД використовують поза- і внутрішньоклітинні електроди. При позаклітинному відведенні електроди підводять до зовнішньої поверхні клітини (волокна). Реєстрація ПД за допомогою позаклітинних електродів показала, що поверхня збудженої ділянки на дуже короткий час (мілісекунди) стає зарядженою негативно відносно сусідньої иезбудженої ділянки.

Мал. 2. Механізм виникнення двофазного потенціалу дії: а, б — відвідні електроди

Залежно від умов відведення розрізняють двофазний та однофазний ПД. Перший виникає, коли збудження, що поширюється нервовою чи м'язовою клітиною, проходить послідовно спочатку під одним, а потім під другим відвідним електродом. Щоб отримати однофазний ПД, треба ділянку тканини під другим, що знаходиться далі від подразнювальних, електродом зруйнувати. Тоді збудження не досягає другого електрода і на екрані осцилографа ми бачимо лише першу фазу ПД.

При внутрішньоклітинному відведені можна кількісно охарактеризувати зміни МПС при генерації ПД. У типовому внутрішньоклітинному ПД розрізняють пік (верхівку), висхідну, низхідну фази і слідові потенціали. Встановлено, що під час висхідної фази ПД відбувається не просто зникнення трансмембранної різниці потенціалів (деполяризація мембрани), а виникає різниця потенціалів протилежного знака (овершут), внутрішня частина мембрани в ділянці генерації ПД стає на певний час зарядженою позитивно відносно зовнішньої частини мембрани, зарядженої негативно.

Під час низхідної фази ПД відновлюється початкове значення МП (реполяризація мембрани). Тривалість піку ПД різних збудливих тканин варіює від 0,5 до 3 мс. Зміни поляризації мембрани, які спостерігаються після завершення високовольтної частини ПД (піку), називають слідовими потенціалами. Розрізняють два види слідових потенціалів — слідову деполяризацію (слідовий негативний потенціал) і слідову гіперполяризацію (слідовий позитивний потенціал), амплітуда яких не перевищує кількох мілівольт (5-10% рівня піку), а тривалість буває різною — від кількох мілісекунд до десятків секунд .

Іонний механізм генерації ПД. В основі генерації ПД лежать зміни проникності клітинної мембрани, що виникають послідовно за часом. У момент подразнення провідність мембрани для Nа⁺ зростає. Nа⁺ починає надходити в клітину, знижуючи внутрішній негативний заряд мембрани, тобто виникає деполяризація клітинної мембрани. При досягненні мембраною певного — критичного — рівня деполяризації виникає лавиноподібний потік Nа⁺ всередину клітини, що зумовлює появу висхідного коліна ПД. У цей момент g_Nа зростає у 100 разів порівняно з: станом спокою і стає у 20 разів більшої за g_к. І якщо g_Nа збільшується далі, то заряд мембрани в місці подразнення змінюється — виникає реверсія знака МП. Проте під час збудження позитивне значення ПД (овершут) не може бути білішим за натрієвий рівноважний потенціал, (Е_Nа), який становить +65мВ. Звичайно овершут не перевищує + 30 мВ.

Існує принаймні дві причини цього явища: 1) підвищення g_Nа не триває довго, коли досягнуто піка ПД (протягом 1 мс), g_Nа починає різко падати, так що мембрана не встигає перезарядитися до + 65 мВ; 2) в той самий час, приблизно в межах 1 мс після початку збудження, відбувається повільніше зростання g_к, що зумовлює фазу реполяризації мембрани.

Натрієва провідність досягає максимуму менш ніж за 1 мс після початку ПД, а потім різко знижується, зникаючи зовсім протягом 0,5 мс, хоча деполяризація мембрани ще зберігається. Це явище називають натрієвою інактивацією, яка існує доти, доки триває деполяризація мембрани. Натрієва активаційна система відновлюється, коли МПС повертається до початкового рівня або навіть при певній гіперполяризації мембрани. На відміну від g_Nа, g_к не інактивується і навіть зростає доти, доки існує деполяризація мембрани.

Зміни збудливості клітини під час збудження. Під час натрієвої інактивації будь-яка деполяризація мембрани абсолютно неефективна, тобто клітина в цей час незбудлива. Це абсолютний рефрактерний період, який триває 1—2 мс. Потім протягом кількох мілісекунд після закінчення абсолютної рефрактерності нове збудження можна викликати лише більшою силою подразнення, ніж перший ПД. Значення ПД в цей час також зменшене, оскільки натрієва система не повністю відновлена після інактивації під час першого ПД. Цей відрізок часу, протягом якого відбувається відновлення збудливості клітини, називають відносним рефрактерним періодом.

Абсолютний рефрактерний період обмежує максимальну частоту генерації ПД живою клітиною. Оскільки у більшості нервових клітин П Д триває близько 2 мс, то максимально можлива частота генерації ПД у них буде 500 за 1 с. Проте є клітини з ще коротшим рефрактерним періодом, які мають частоту генерації до 1000 за 1 с. Зазвичай частота генерації ПД в ЦНС не перевищує кількох десятків ПД за 1 с.

Мембранна провідність під час розвитку ПД у гігантському аксоні кальмара

Під час слідової деполяризації збудливість клітини підвищується (фаза екзальтації), а під час слідової гіперполяризації — знижується, оскільки значення МПС у цей час зростає, при цьому збільшується і критичний (пороговий) рівень деполяризації мембрани.

У живій клітині існують дві системи руху іонів крізь мембрану. Одна з них здійснюється за градієнтом концентрації іонів і не потребує витрати енергії — це пасивний іонний транспорт. Він відповідає за підтримання МПС і виникнення ПД, здійснюється через іонні канали. Друга система руху іонів крізь мембрану відбувається проти концентраційного градієнта і полягає у "викачуванні" Na⁺ з цитоплазми і "закачуванні" К⁺ всередину клітини за допомогою іонних насосів. Цей механізм можливий тільки з витратами енергії і називається активним іонним транспортом.

Мал. 3. Холінорецептор електричного органа риби:

тривимірне зображення рецептора збоку (а) і згори (б); е — активація рецептора ацетилхоліном (АЦХ); А — ворота зачинені;Б—ворота відчинені

Функції іонних каналів. У клітинній мембрані існують пори, або канали. Терміном "канал" позначають той шлях, яким іони проходять крізь мембрану за електрохімічним градієнтом. У клітинній мембрані існує кілька різних іонних каналів: селективних та неселективних. Перші пропускають лише якийсь певний іон: Na⁺, К⁺ або Са²⁺, а другі — кілька іонів. Крім того, селективні канали поділяють на потенціалозалежні, потенціалонезалежні (хемочутливі) і канали витоку.

Іонні канали

Селективні (для Na+, К+ або Са2+ )			Неселективні
Потенціалонезалежні	Потенціалозалежні (хемочутливі)	Канали витоку

Потенціалозалежні канали. Провідність цих каналів контролюється рівнем МПС, тобто ці канали відкриваються (активуються) і закриваються (інактивуються) у відповідь на зміни МПС. Потенціалозалежні канали функціонують в електрозбудливих мембранах і беруть участь у генерації ПД. Електрична збудливість пов’язана з існуванням у таких каналах особливого молекулярного пристрою — воріт, відкривання і закривання яких визначається електричним полем мембрани.

Деполяризація мембрани, мВ

Мал. Іонні струми і зміна провідності при зміні МП у гігантському аксоні кальмара: зверху показано деполяризаційне зрушення потенціалу від -60 до 0 мВ. Верхні криві показують підсумковий струм фіксації I та його компоненти I_к і I_Na; нижні криві показують часовий перебіг змін мембранної провідності g_Nа і g_к, розрахованих за рівнем струмів фіксації

Ворота можуть перебувати тільки у двох положеннях: повністю відчиненими чи повністю зачиненими, тому провідність поодинокого іонного каналу є сталою. Через відкриті канали іони рухаються за концентраційним і електрохімічним градієнтами. Ці потоки іонів зумовлюють зміну МПС, що, в свою чергу, змінює середню кількість відкритих каналів і відповідно рівень іонних струмів.

Для дослідження функції іонних каналів застосовують різні методи. Один із них це метод фіксації напруги на мембрані за допомогою якого на мембрані штучно підтримується будь-який потрібний потенціал. Функцію каналів відбивають іонні струми, які в цей час проходять крізь мембрану.

Потенціалозалежними є натрієві, калієві і кальцієві канали. Натрієві і кальцієві канали відповідають за ранній (початковий) струм вхідного (в клітину) напрямку, а калієві — за пізній (відставлений) струм вихідного (з клітини) напрямку.

Рівень g_Nа і g_к відбиває кількість одночасно відкритих натрієвих і калієвих каналів. Як можна побачити, g_Nа за частки мілісекунди досягає максимуму, а потім повільно знижується до початкового рівня. Це пояснюється наявністю у натрієвих каналах двох типів воріт — швидких активаційних і повільних інактиваційних. Отже, початкове збільшення g_Nа пов'язане з відкриванням перших воріт (процес активації), а наступне повільне зниження g_Nа, що відбувається під час деполяризації мембрани, зумовлене: закриванням других воріт (процес інактктивації).

Натрієвим каналам властива досить висока, але не абсолютна вибірковість Nа⁺, оскільки більшою або меншою вони є проникними також для іонів літію, талію і навіть деяких органічних катіонів (гідразин, амоній). Отвір натрієвого каналу має прямокутну форму розмірами 0,3х0,3 нм. Вузька частина каналу, що є селективним фільтром, дуже коротка і має одиничний негативний заряд. Цей заряд притягує катіони, відштовхує аніони, забезпечуючи вибіркову проникність для Nа⁺ і подібних до нього катіонів.

а б в

Мал. Потенціалозалежний натрієвий канал:

Внутрішня частина каналу (1), утвореного макромолекулою білка (2), — це селективний фільтр; т — активаційні. h — інактиваційні: - ворота каналу; а — стан спокою (активаційні ворота зачинені, інактнваційні — відчинені); б — початок деполяризації мембрани (швидке відчинення активаційних воріт); в — інактивація каналу (інактиваційні ворота зачине­ні); поверхня клітинної мембрани: А — зовнішня; Б — цитоплазматична

Активаційні та інактиваційні ворота розміщені біля внутрішнього кінця натрієвого каналу, причому інактиваційні ворота спрямовані в бік цитоплазми. У стані спокою активаційні ворота закриті, а інактиваційні відкриті. Під час деполяризації мембрани спочатку відкриті обидва типи воріт, тобто канал пропускає Nа⁺. Потім інактиваційні ворота повільно закриваються — канал інактивується. Лише після закінчення деполяризації поступово відкриваються іиактиваційні ворота, а активаційні закриваються і канал повертається до початкового стану.

Деякі речовини специфічно змінюють процеси активації та інактивації натрієвих каналів. Так, батрахотоксин спричинює стійку деполяризацію клітинної мембрани, підвищуючи g_Na. Він повністю усуває процес натрієвої інактивації так, що натрієві канали стають постійно відкритими. Тетродотаксин дуже швидко і різко пригнічує ранній іонний струм крізь мембрану, але тільки коли він діє із зовні, тобто на чутливі до тетродотоксину рецепторні структури натрієвих каналів, розміщені на зовнішній поверхні мембрани.

Калієві канали за будовою подібні до натрієвих, але відрізняються своєю вибірковістю, спрямованістю потоку іонів, кінетикою процесів інактивації і активації. В усіх збудливих клітинах калієві канали відповідають за пізній іонний струм. Діаметр калієвого каналу у найвужчій його частині становить 0,3 нм. Отже, калієві канали проникні для катіонів розміром 0,26-0,З нм (К⁺,RЬ⁺).

Активація цих каналів порівняно з натрієвими відбувається досить повільно. Крім того, протягом перших 10 мс деполяризації немає ніякої калієвої інактивації, вона виникає тільки під час дуже тривалої (кілька секунд) деполяризації мембрани.

Викладене вище про співвідношення між процесами активації та інактивації калієвих каналів властиве лише нервовим волокнам. У мембрані багатьох нервових і м'язових клітин існують калієві канали, які інактивуються порівняно швидко. Виявлено також калієві канали з швидкою активацією. Нарешті, є калієві канали, які активуються не мембранним потенціалом, а внутрішньоклітинним Са²⁺. Щільність розміщення калієвих каналів на мембрані дещо менша, ніж натрієвих. Специфічним блокатором калієвих каналів є тетраетиламоній (ТЕА), іони гідрогену, амінопіридини. ТЕА діє з будь-якого боку клітинної мембрани.

Кальцієві канали. Ретельне дослідження функції іонних каналів різних нервових клітин дало змогу модифікувати іонну модель генерації ПД, запропоновану Ходжкіним і Хакслі, до якої входили лише натрієві й калієві канали. Виявилося, що Са²⁺ також беруть активну участь у генерації ПД. З'ясувалося також, що в деяких клітинах вхідний струм створюється переважно Са²⁺ (гладком'язові клітини). Крім порівняно швидкого вхідного кальцієвого струму, що бере участь у генерації ПД, було виявлено ще один дуже повільний кальцієвий струм. Цей струм відповідає за повільну деполяризацію (протягом кількох секунд), яка зумовлює генерацію серій імпульсів деяких пейсмекерних клітин, наприклад серцевих провідних міоцитів (клітин Пуркіньє).

Селективність (вибірковість) кальцієвих каналів зумовлена наявністю в ділянці зовнішнього входу хімічних груп, які мають підвищену спорідненість до двовалентних катіонів: іони кальцію зв'язуються з такими групами і тільки після цього проходять до порожнини каналу. До деяких двовалентних катіонів, наприклад Мn²⁺, спорідненість цих хімічних груп така велика, що, зв'язуючись з ними, ці катіони блокують рух Са²⁺ через канал.

Характерною особливістю кальцієвих каналів є залежність їх від клітинного метаболізму, зокрема від циклічних нуклеотидів (цАМФ, цГМФ), які регулюють процеси фосфоритування і дефосфоритування білків кальцієвих каналів. Іони кальцію ефективно впливають на синтез білків і забезпечують транспорт утворених молекул до аксонів і дендритів. Відкриття цього явища безпосередньо свідчило про те, що процеси на мембрані прямо пов'язані з процесами всередині клітини.

Дослідження останніх років показали, що Са²⁺ є важливим регулятором активності збудливих систем. Переважна кількість Са²⁺, що потрапляє в клітини під час збудження, зв'язується буферними системами цитозолю, мітохондріями та іншими внутрішньоклітинними депо. Проте та невелика частина Са²*, що залишається вільною, бере активну участь у таких процесах, як регуляція функції К⁺ і Сl^— каналів, Са²⁺ , Nа⁺ обміну тощо.

Виявлено ще одну особливість кальцієвих каналів: вони здатні дуже специфічно реагувати на деякі фізіологічні речовини, що утворюються іншими клітинами і виділяються у внутрішнє середовище організму (катехоламіни, пептиди тощо). Під впливом цих речовин канали активуються чи, навпаки, інактивуються

Внаслідок цього змінюється активність нервової клітини.

Потенціалонезалежні (хемочутливі) канали. Активність цих каналів контролюється тільки хеморецепторами. Активація хеморецепторів медіаторами супроводжується здебільшого відкриванням каналів. Хемочутливі потенціалонезалежні канали функціонують у субсінаптичних мембранах і беруть участь у: генерації синоптичних потенціалів. Вони реагують не тільки на нейромедіатори, а й на гормони та деякі інші фізіологічно активні речовини.

Канали витоку також потенціалонезалежні, але вони не контролюються хеморецепторами. Ці канали відіграють істотну роль у сумарній провідності мембран у стані спокою, саме їхньою активністю пояснюють менші значення МПС порівняно з розрахованим за рівнянням. Функцію цих каналів ще не з’ясовано.

Кожний потенціалозалежний іонний канал навіть за сталих значень МПС то відкривається, то закривається. Це відбувається незакономірно, тобто процес має ймовірний (стохастичний) характер. Таке явище викликає переміщення іонів і створює електричний шум. Аналіз цих шумів дав змогу розрахувати щільність розміщення іонних каналів у мембрані і провідність одного каналу.

Так, у гігантському аксоні кальмара щільність натрієвих каналів становить 300 на 1 мкм², середня провідність –4 пСм (пікосименсів); у вузлах нервового волокна (перетяжках Ранв'є) щільність натрієвих каналів значно вища — 2000 на 1 мкм; а провідність удвічі більша — 8 пСм. _