2.3 Методика определения сахара в сухих винах с использованием колоночной хроматографии методом рефрактометрии

Общая характеристика метода

Рефрактометрия – оптический метод исследования, основанный на измерении показателя преломления луча света, проходящего через исследуемое вещество.

В основе метода лежит явление рефракции, то есть преломление световых лучей на границе раздела двух различных по своей природе оптических сред.

Рефракция света является следствием его взаимодействия с частицами вещества, через которое проходит свет. Под воздействием электромагнитных колебаний света в атомах вещества возникают вынужденные колебания электронов и ядер. Вследствие этого происходит их смещение относительно друг друга, что приводит к несовпадению «центров тяжести» отрицательного и положительного электричества в атомах и молекулах, то есть атомы, и молекулы вещества поляризуются в электромагнитном поле света.

Преломление света оценивается показателем преломления n, который равен отношению синуса угла падения α к синусу угла преломления β:

(2.15)

Показатель преломления зависит от ряда факторов: природы вещества, длины волны падающего света, плотности среды, концентрации раствора и температуры. Существует прямолинейная зависимость между величиной показателя преломления и концентрацией сахара в водном растворе, которая используется при определении концентрации сахара в растворах.

Метод рефрактометрии применяется также для идентификации веществ, определения их чистоты и концентрации в растворе.

Зависимость показателя преломления от плотности вещества выражается формулой:

(2.16)

где n – показатель преломления;

r – удельная рефракция вещества, см³/г;

d – плотность вещества, г/см³.

Функция f(n) выражается соотношением:

(2.17)

Отсюда

(2.18)

Размерность удельной рефракции соответствует удельному объему, то есть r, см³/г.

Умножение удельной рефракции r на молярную массу вещества М_В дает величину молярной рефракции R_M:

(2.19)

Подставив значение удельной рефракции r в формулу (2.19), получают уравнение, связывающее молярную рефракцию вещества с его плотностью, молярной массой и поляризуемостью:

(2.20)

где R_M – молярная рефракция вещества В см³/моль;

М_В – молярная масса вещества В, г/моль;

n – показатель преломления вещества В;

d – плотность вещества В, г/см³.

Выражение (2.20) носит название формулы Лорентц – Лоренца. Она при меняется в расчетах и достаточно точно отвечает правилу аддитивности молекулярной рефракции. Рассчитанные по этой формуле результаты мало зависят от изменений температуры, давления и агрегатного состояния вещества во время анализа.

Правило аддитивности молекулярной рефракции заключается в следующем: сумма атомных рефракций элементов, входящих в соединение, равна молекулярной рефракции этого соединения.

(2.21)

где α – коэффициент поляризуемости, см3;

NA – постоянная Авогадро, 6,02204∙10²³ моль^–1.

Коэффициент поляризуемости (α) зависит от объема атомов и молекул вещества и не зависит от температуры. Экспериментально установлено, что α ≈ r³, где r – радиус поляризованной молекулы.

Физический смысл молярной рефракции поясняет соотношение:

(2.22)

где N_A – число молекул в 1 моль вещества, моль^–1;

– объем шара, т.е. объем поляризованной молекулы;

Отсюда следует, что R_M – суммарный объем всех поляризованных молекул, содержащихся в 1 моль вещества. Объем поляризованных молекул состоит из объемов атомов и объемов, занимаемых двойными и тройными связями. Объем атомов называют атомной рефракцией R_ат, а объем связи – рефракцией связи R_св. Из сказанного видно, что молярная рефракция – аддитивная величина.

Значения рефракций атомов некоторых элементов и связей представлены в таблице 2.8

Таблица 2.8– Атомные рефракции и рефракции связей по Фогелю

Атомные рефракции		Рефракции связи
Название атома	Rат		Вид связи	Rсв
Углерод	2,591		C – H	1,676
Водород	1,028		C – C	1,296
Кислород	1,610		C – O в ацеталях	1,460
Азот (NH2)	4,438		О – С в спиртах	1,660
			С = С	4,17

Сущность определения содержания сахара в сухих винах с использованием колоночной хроматографии методом рефрактометрии

Рефрактометрическое определение содержания сахара в пищевых продуктах основано на существовании прямолинейной зависимости между величиной показателя преломления и концентрацией сахара в растворе.

Оборудование

1. Рефрактометр ИРФ – 454 БМ;

2. Аналитические весы;

3. Мерные колбы объемом 25 см³ (5 шт.);

4. Пипетка глазная;

5. Хроматографическая колонка;

6. Фильтровальная бумага.

Применяемые реактивы

1. Водно – спиртовый раствор. Приготовление ведется с учетом содержания спирта. Например, на этикетке указано «Алк. 9 – 11% об.», следовательно, водно – спиртовый раствор готовится в соотношении 91:9 частей;

2. Дистиллированная вода;

3. Вино.

Рефрактометр ИРФ – 454БМ

Измерение показателя преломления исследуемых веществ проводят на рефрактометре ИРФ – 454БМ, принцип действия которого основан на явлении полного внутреннего отражения при прохождении светом границы раздела двух сред с разными показателями преломления. Все измерения проводят в «белом свете» (дневном или электрическом). Для получения высокой точности показатели преломления исследуемых жидкостей замеряют при определенной температуре и определенной длине волны.

Рисунок 2.14 – Рефрактометр ИРФ – 454БМ

1 – окуляр; 2 – маховики; 3, 4 – зеркала; 5 – рефрактометрический блок с подвижной (а) и неподвижной (б) призмами; 6 – заслонка; 7 – крючок; 8 – корпус прибора; 9 – место установки термометра

Рисунок 2.15 – Схема призм рефрактометра

1 – измерительная призма; 2 – исследуемая жидкость; 3 – осветительная призма

Порядок работы рефрактометра ИРФ – 454БМ

Рефрактометр устанавливают так, чтобы свет падал на входное окно осветительной призмы и на зеркало, которым направляют свет во входное окно измерительной призмы. Для этого нужно открыть заслонку 6 и зеркала 3, 4 (см. рисунок 2.14).

Осветительную призму открыть на угол 100°. На чистую полированную поверхность измерительной призмы 1 (см. рисунок 2.15) стеклянной палочкой или пипеткой, не касаясь призмы, нанести 2 – 3 капли жидкости так, чтобы вся поверхность была покрыта пленкой жидкости. Опустить осветительную призму 3 и прижать ее крючком 7. Измерения прозрачных жидкостей проводят в проходящем свете, когда он проходит через открытое окно осветительной призмы.

Лучи света проходят осветительную призму 3, рассеиваясь на выходе матовой гранью А₁В₁, входят в исследуемую жидкость и падают на полированную грань АВ измерительной призмы 1 (см. рисунок 2.15). Поворотом зеркала 3 (см. рисунок 2.14) ярко освещают призму белым светом. Все поле в окуляре должно быть освещено равномерно.

Наличие темных пятен указывает на недостаточное количество взятой для анализа жидкости. В таком случае призмы раскрывают и добавляют несколько капель исследуемой жидкости и снова плотно сжимают их.

До начала измерений проверьте чистоту осветительной и измерительной призм прибора (смочите их дистиллированной водой и протрите чистой мягкой салфеткой).

Перед измерениями проверяют рефрактометр по дистиллированной воде:

а) на чистую полированную поверхность измерительной призмы осторожно, не касаясь ее поверхности, наносят пипеткой 2 – 3 капли дистиллированной воды и опускают осветительную призму;

б) поворотом зеркала добиваются наилучшей освещенности шкалы. Вращением нижнего маховика, расположенного на правой стороне рефрактометра и смотря в окуляр, границу светотени вводят в поле зрения окуляра 1. Вращением верхнего маховика устраняют цветную окраску границы раздела света и тени и наводят ее на резкость;

в) наблюдая в окуляр, совмещают центр перекрестия с линией светотени с помощью нижнего маховика и измеряют значение показателя преломления воды на шкале, расположенной внизу окуляра.

При 20°С показатель преломления воды n_D = 1,3330. Если опыт проводился при другой температуре (измерить температуру воды термометром), то вводится температурная поправка к полученному значению показателя преломления для воды:

Δn = 0,0565 ∙ 10–4 + 10–4 ∙ (t0 – 10)

(2.23)

где 10^–4 – температурный коэффициент показателя преломления дистиллированной воды, 1/град.

n = n′D + Δn

(2.24)

Совпадение экспериментально полученного значения n с данными таблицы 2.9 при той же температуре говорит о том, что рефрактометр настроен.

Таблица 2.9 – Температурные отклонения показателя преломления воды

t,°C	nD	t,°C	nD
15	1,3335	23	1,3327
16	1,3334	24	1,3326
17	1,3333	25	1,3325
18	1,3332	26	1,3324
19	1,3331	27	1,3323
20	1,3330	28	1,3322
21	1,3329	29	1,3321
22	1,3328	30	1,3320

Выполнение работы

1) Приготовить растворы для построения градуировочного графика

Готовят пять градуировочных растворов сахарозы в мерных колбах емкостью 25 см³, охватывая диапазон ожидаемой концентрации в исследуемом образце (например, на этикетке вина написано: «сахара 30 – 50 г/дм³», следовательно, нужно приготовить растворы сахара концентрации 20; 30; 40; 50; 60 г/дм³). В качестве растворителя используют водно – спиртовый раствор.

Градуировочные растворы готовятся из массы навески сахарозы при приготовлении 25 см³ раствора с концентрацией сахара 20 г/дм³ по соотношению:

20 г – 1000 см³.

m₁, г – 25 см³.

Навеску сахарозы количественно переносят через воронку в мерную колбу вместимостью 25 см³. В колбу добавляют водно – спиртовой раствор на ½ ее объема и перемешивают содержимое до полного растворения сахарозы. Затем оставшийся объем довести до метки водно – спиртовым раствором и перемешивают. Аналогично рассчитывают и готовят растворы других концентраций.

2) Измерить показатель преломления градуировочных растворов:

а) приподнять осветительную призму и поверхности обеих призм осторожно протереть фильтровальной бумагой;

б) нанести 2 капли раствора на поверхность измерительной призмы и опустить осветительную призму;

в) поворотом верхнего маховика установить границу светлого и темного полей. Она должна быть четкой и не иметь радужной окраски;

г) вращать нижний маховик до совпадения границы темного и светлого участка поля зрения.

д) полученные данные занести в таблицу 2.10;

Таблица 2.10 – Результаты эксперимента

№ коблы	Концентрация сахарозы, г/дм3	Показатель преломления
водно – спиртовой раствор	–
1
2
3
4
5

3) Подготовить исследуемый продукт к анализу. Вино, полученное для анализа предварительно пропускают через хроматографическую колонку, заполненную активированным углем, чтобы отделить красящие органические вещества. Устанавливают скорость капания, равную вытеканию 1 капли через каждые 3 с. Если вино недостаточно осветлилось, операцию повторяют 2 – 3 раза.

4) Измерения показателя преломления очищенного вина ведется аналогично измерению показателя преломления градуировочных растворов.

5) По окончании измерений промыть обе призмы дистиллированной водой и вытереть насухо фильтровальной бумагой.

6) Построить градуировочный график по результатам таблицы 2.10.

7) Используя градуировочный график, определите содержание сахарозы в вине, и сравнить с данными на этикетке бутылки.

Обработка результатов эксперимента

1) Проверяют рефрактометр по дистиллированной воде

Показатель преломления по дистиллированной воде n = 1,3302 при температуре проведения эксперимента Т = 28,8°С

Δn = 0,0565 ∙ 10^–4 + 1 ∙ 10^–4(t – 10) = 0,0565 ∙ 10^–4 + 1 ∙ 10^–4(28,8 – 10) = 1,89 · 10^–3

n = n′_D + Δn = 1,3302 + 1,89 · 10^–3 = 1,33209 ~ 1,3321

2) Построить градуировочный график по результатам таблицы 2.11

Таблица 2.11– Результаты эксперимента

№ колбы	Концентрация сахарозы, г/дм3	Показатель преломления
водно – спиртовой раствор	−	1,3340
1	25	1,3380
2	30	1,3385
3	35	1,3390
4	40	1,3395
5	45	1,3400

Рисунок 2.16 – График зависимости показателя преломления n от концентрации водно – спиртового раствора сахарозы, г/дм³

3) Используя градуировочный график, определить содержание сахарозы в вине, и сравнить с данными на этикетке бутылки.

Показатель преломления для образца вина n = 1,3390

Уравнение прямолинейной зависимости показателя преломления n от концентрации водно – спиртового раствора сахарозы, г/дм³: n = 1,34426 · 10⁻⁴ · C + 1,33425, следовательно:

n = 1,34426 · 10⁻⁴ · C + 1,33425

1,3390 = 1,34426 · 10⁻⁴ · C + 1,33425

0,00475 = 1,34426 · 10⁻⁴ · C

C = 35,3354 ~ 35,33 г/дм³

Анализируемое винное изделие – полусладкое белое столовое вино «Русская Лоза Мускат», алк 10 – 12%, сахар 30 – 40% объем 0,7л