Изучение метафазных хромосом

Оптимальным этапом для изучения хромосом является стадия метафазы, когда хромосомы достигают максимальной конденсации и располагаются в одной плоскости. Для изучения кариотипа требуется выполнение нескольких условий:

- стимуляция клеточных делений для получения максимального количества делящихся клеток,

- блокирование клеточного деления в метафазе;

- гипотонизацш клеток и приготовление препарата хромосом для дальнейшего исследования под микроскопом.

Для изучения хромосом можно использовать клетки из активно пролиферирующих тканей (клетки костного мозга, стенок семенников, опухолей) или клеточные культуры, которые получают путём культивирования в контролируемых условиях на специальных питательных средах клеток, выделенных из организма (клетки периферической крови*, лимфоциты Т, клетки красного костного мозга)

* Техника получения хромосомных препаратов из лимфоцитов периферической крови, культивируемых в изолированных условиях является наиболее простым методом и состоит из следующих этапов:

- забор венозной крови в асептических условиях;

- добавление гепарина для предотвращения свертывания крови;

- перенос материала во флаконы со специальной питательной средой;

- стимуляция клеточных делений добавлением фитогемагглютинина;

- инкубация культуры в течение 72 часов при температуре 37⁰С.

Блокирование клеточного деления на стадии метафазы достигается введением в среду колхицина или колцемида – веществ - цитостатиков, разрушающих веретено деления. Получение препаратов для микроскопического анализа включает следующие этапы:

- гипотонизацю клеток, которая достигается добавлением гипотонического раствора хлорида калия; это приводит к набуханию клетки, разрыву ядерной оболочки и дисперсии хромосом;

- фиксацию клеток для остановки жизнедеятельности клетки с сохранением структуры хромосом; для этого используются специальные фиксаторы, например, смесь этилового спирта и уксусной кислоты;

- окрашивание препарата по Гимзе или использование других способов окрашивания;

- анализ под микроскопом с целью выявления численных нарушений (гомогенных или в мозаике) и структурных аберраций;

- фотографирование и вырезание хромосом;

- идентификацию хромосом и составление кариограммы (идиограммы).

Этапы кариотипирования Дифференциальная окраска хромосом

Используются методы дифференциальной окраски, позволяющие выявить в хроматидах чередование окрашенных и неокрашенных полос. Они называются бэндами и имеют специфическое и точное распределение. Используя метод дифференциальной окраски, в каждой хромосоме можно выявить реперы - важные элементы для идентификации хромосомы :

- чередование бэндов,

- центромера,

- теломеры.

Хромосомные реперы ограничивают районы хромосом, каждый из которых содержит несколько бэндов, а бэнды, в свою очередь, состоят из суббэндов.

- чередование полос не носит случайный характер, а отражает внутреннюю структуру хромосом, например распределение эухроматиновых и гетерохроматиновых участков

- распределение бэндов идентично для всех клеток одного организма и всех организмов данного вида, что используется для точной идентификации вида;

- метод позволяет точно идентифицировать гомологичные хромосомы,

- метод обеспечивает точную идентификацию каждой хромосомы,

- дифференциальная окраска позволяет выявить многие структурные нарушения хромосом (делеции, инверсии).

Характеристика различных методов дифференциальной окраски хромосом

Название метода	Используемый краситель	Природа бэндов	Практическая роль
Метод G	Giemsa(раствор азур-эозина и эозина в глицерине и метиловом спирте)	Окрашенные - гетерохроматин; неокрашенные - эухроматин	Выявление численных и структурных аномалий хромосом
Метод Q	Куинакрин (флюоресцентный краситель)	Окрашенные - гетерохроматин; неокрашенные - эухроматин	Выявление численных и структурных аномалий хромосом
Метод R (реверс)	Giemsa или флюоресцентный краситель	Окрашенные - эухроматин; неокрашенные - гетерохроматин	Выявление численных и структурных аномалий хромосом
Метод C	Giemsa или флюоресцентный краситель	Окрашенные центромерный гетерохроматин	Анализ полиморфизма хромосом
Метод Т	Giemsa или флюоресцентный краситель	окрашенные - теломерный гетерохроматин	Анализ полиморфизма хромосом

Вопрос №13. Молекулярно-цитогенетические методы ( FISH, CGH, SKY)

На основе методов молекулярного анализа нуклеиновых кислот была разработана серия новых техник изучения интерфазных хромосом, характеризующихся высокой специфичностью и точностью - методы гибридизации in situ (FISH, CGH, SKY).

Метод FISH- флуоресцентная гибридизация in situ - включает следующие этапы:

- создание зондов - однонитевых фрагментов ДНК, к которым присоединяют биотин или дигоксигенин;

- щелочная обработка препаратов in situ с целью денатурации хромосомной ДНК за счет разрыва водородных связей между двумя цепями ДНК;

- гибридизация хромосомной ДНК с зондом путем комплементарного связывания зонда со специфической последовательностью хромосомы;

- обработка препаратов веществами, которые избирательно связываются с биотином и дигоксегенином; для биотина таким веществом является стрептовидин, для дигоксегенина - антидигоксигениновое антитело;

- визуализация хромосом с помощью люминесцентного микроскопа на фоне неокрашенных хромосом.

Метод FISH используется для выявления:

- численных хромосомных аномалий в интерфазном ядре;

- структурных аномалий;

- сложных межхромосомных перестроек;

- локализации гена.

CGH - метод сравнительной геномной гибридизации, используется в онкологической цитогенетике для выявления делетированных (выпавших) или амплифицированных участков хромосом при некоторых типах опухолей. Делетированные участки, содержат гены-супрессоры опухолей, а амплифицированные участки - онкогены. Это позволяет использовать метод для картирования и клонирования генов, вовлеченных в канцерогенез.

Ген-супрессор опухолей (антионкоген, опухолевый супрессор) — ген, продукт которого обеспечивает профилактику опухолевой трансформации клеток.

Метод CGH заключается в следующем: ДНК, выделенную из опухоли и из нормальной ткани, метят разными флуорохромами. Меченую ДНК из опухоли и нормальной ткани гибридизуют с хромосомным препаратом, и по интенсивности свечения метки определяют участки, содержащие делеции и амплификации. Для обработки данных используют специальные программы компьютерного анализа.

SKY - спектроскопический анализ хромосом. Метод основан на использовании набора зондов и флуоресцентных красителей, имеющих сродство к определенным участкам хромосом. Каждая пара хромосом имеет уникальные спектральные характеристики. Используя интерферометр, аналог аппарата для измерения спектра астрономических объектов, можно определить незначительные вариации в спектральном составе хромосом, неразличимые человеческим глазом. Данные подвергаются компьютерной обработке по специальной программе, в результате чего каждая пара хромосом приобретает определенный цвет. Преимущество метода состоит в более точной идентификации гомологичных хромосом, которые имеют один и тот же цвет, и возможности выявления некоторых транслокаций. Метод используется в онкоцитогенетике для выявления в кариотипе опухолевых клеток даже очень незначительных по величине хромосомных аберраций.

Вопрос №14. Номенклатура хромосом человека (Международная система стандартизации)

Номенклатура хромосом человека основана на международной системе стандартизации, которая позволяет обозначить нормальный или патологический кариотипы с использованием специальных символов и знаков, отражающих число хромосом и тип нарушения - недостаток, избыток или перераспределение хромосомного материала.