18. Иммунофлуоресцентный метод (прямой и непрямой) диагностики инфекционных болезней. Сущность метода, его преимущества и недостатки.

Реакция иммунофлуоресценции.

Молекулы иммуноглобулинов способны необратимо связываться (метиться) с некоторыми химическими веществами без потери своей антительной специфичности и свойства связываться с антигеном. Для такого мечения можно использовать красители, флуоресцирующие при облучении их коротковолновым светом (ультрафиолетовым, фиолетовым, синим), например изотиоционат флуо- ресцеина, дающий зеленовато-желтое окрашивание, или другие флуорохромы. Использование для обнаружения антигенов меченных флуорохромами антител, т. е. реакцию иммунофлуоресценции (РИФ), предложил в 1950 г. А. Куне. С по-мощью РИФ можно быстро обнаруживать даже ничтожные количества антиге¬нов, в том числе бактериальных и вирусных, по эффекту флуоресценции ком¬плекса антиген + антитело в люминесцентном микроскопе.

2 метода:

-прямого метод РИФ(в этом случае метят антитела, которые не¬посредственно участвуют в реакции с исследуемым антигеном)

-непрямой метод РИФ(в этом случае с исследуемым антигеном вначале взаимодействуют специфические к нему антитела, а уже с ними взаимодействуют антивидовые антитела (антитела против иммуноглобули¬нов диагностической сыворотки), меченные флуорохромом )

Преимуществом непрямого метода РИФ является то, что при его использовании отпадает необходимость иметь большой набор различных специфических флуоресцирующих антител, так как он основан на использовании антиглобулиновых антител. В качестве последних обычно используют сыворотку козы или барана, иммунизи¬рованных сывороткой кролика (коммерческие диагностические иммунные сыворотки чаще всего готовят путем иммунизации кроликов). Непрямой метод иммунофлуо-ресценции применяют не только для ускоренного обнаружения антигенов (воз¬будителя), но и для обнаружения антител в сыворотке крови больных. Например, для серологической диагностики токсоплазмоза токсоплазмы фиксируют на предметном стекле и обрабатывают сывороткой исследуемого больного. После ее отмывки мазок повторно обрабатывают сывороткой, содержащей меченные флуорохромом антитела против человеческого глобулина. Если в крови больно¬го есть антитела, т. е. человек болен, в люминесцентный микроскоп будут видны светящиеся токсоплазмы.

19. Агглютинины и реакция агглютинации. 0- и Н-агглютинация бактерий. Механизм реакции агглютинации. Получение агглютинирующих сывороток. Методика поста¬новки и оценки результатов развернутой реакции агглютинации.

Реакция агглютинации

Агглютинация - склеивание (соединение) антигеннесущих корпускулярных частиц (цельные клетки, частицы латекса и др.) молекулами специфических антител в присутствии электролитов, которое закан-чивается образованием видимых невооруженным глазом хлопьев или осадка (агглютината).

В реакции агглютинации участвуют главным образом антитела, относящиеся к классам IgG и IgМ. Она протекает в две фазы: вначале происходит специфическое взаимодействие активного цент¬ра антител с детерминантом антигена, эта стадия может происходить в отсут¬ствие электролитов и не сопровождается видимыми изменениями реагирующей си¬стемы. Для второй стадии — образования агглютината — необходимо наличие электролитов, которые снижают электрический заряд комплексов антиген + ан¬титело и ускоряют процесс их склеивания. Эта фаза заканчивается образованием агглютината.

Реакции агглютинации ставят либо на стеклянных, либо на гладких картонных пластинках, либо в стерильных агглютинационных пробирках. Реакции агглюти¬нации (прямые и пассивные) на стекле обычно применяют в качестве ускоренно¬го метода обнаружения специфических антител в сыворотке больного (например, при бруцеллезе) или для серологической идентификации возбудителя. В послед¬нем случае обычно используют хорошо очищенные (адсорбированные) диагнос¬тические сыворотки, содержащие только монорецепторные антитела или их на¬бор к различным антигенам. Несомненным достоинством реакции агглютинации на стекле является простота ее постановки и то, что она протекает несколько ми¬нут или даже секунд, так как оба компонента в ней используются в концентриро¬ванном виде. Однако она имеет лишь качественное значение и менее чувствитель¬на, чем пробирочная. Развернутая реакция агглютинации в пробирках дает более точные результаты, ибо она позволяет определить количественное содержание антител в сыворотке (установить ее титр) и при необходимости зарегистрировать факт нарастания титра антител, что имеет диагностическое значение. Для поста¬новки реакции в агглютинационные пробирки вносят определенным образом разведенную 0,85 % раствором NaС1 сыворотку и равный объем (обычно 0,5 мл) суспензии стандартного диагностикума (или исследуемой культуры), содержаще¬го в 1 мл 1 млрд бактерий. Учет результатов реакции агглютинации производят предварительно через 2 ч инкубации пробирок при температуре 37 °С и оконча¬тельно через 20—24 ч по двум признакам: наличию и величине осадка и степени прозрачности надосадочной жидкости. Оценку осуществляют по четырехкрест- ной системе. Реакция обязательно сопровождается контролем сыворотки и антиге¬на. В тех случаях, когда развернутую реакцию агглютинации в пробирке ставят для серологической идентификации возбудителя, она имеет диагностическое зна¬чение, если реакция оценена как положительная при разведении диагностической сыворотки не менее половины ее титра.

Необходимо учесть, что при смешивании растворов гомологичных антигенов и антител не всегда наблюдаются видимые проявления реакции агглютинации. Осадок образуется только при некоторых оптимальных соотношениях обоих компонентов реакции. Вне этих пределов, при значительном избытке антигена или антител, реакции не наблюдается. Это явление получило название «феномена прозоны». Оно наблюдается как при реакции агглютинации, так и при реакции преципитации. Появление прозоны в иммунных реакциях объясняется тем, что участвующие в них антигены, как правило, являются полидетерминантными, а мо¬лекулы антител IgG имеют два активных центра. При избытке антител поверх-ность каждой частицы антигена покрывается молекулами антител так, что не остается свободных детерминантных групп, поэтому второй, несвязанный активный центр антител не может взаимодействовать с другой антигенной частицей и связывать их друг с другом. Образование видимого агглютината или преципитата подав¬ляется также при избытке антигена, когда не остается ни одного свободного актив¬ного центра антител, и поэтому комплексы антиген + антитело + антиген не могут более укрупняться.