24. Микроскопические методы исследования микроорганизмов

Микроорганизмы и вирусы очень малые по своим размерам, так что увидеть их невооруженным глазом невозможно. В то же время морфология микробов, их размеры, форма, взаимное расположение клеток, наличие или отсутствие жгутиков, внутренняя ультраструктура является очень важной их характеристикой и часто служит основой классификации. Ввиду этого, одним из важнейших методов исследования строения микроорганизмов является микроскопия. В основе современных микроскопических методов исследования лежит световая микроскопия с многочисленными ее разновидностями, такими как темнопольная, фазовоконтрастная, аноптральная, поляризационная, интерференционная, люминесцентная и др. При изучении анатомии и ультраструктуры вирусов используют электронную микроскопию.

Современная промышленность выпускает много видов микроскопов в зависимости от их назначения. В практической работе рутинных баклабораторий чаще всего пользуются микроскопами МБР-1, МБР-3.

Микроскоп состоит из механической, оптической и осветительной частей. К механической относят штатив, тубус, револьвер, предметный столик, макро- и микровинт, к оптической  объективы и окуляры, к осветительной зеркало и конденсор.

В верхней части штатива есть тубус, в который вставляется окуляр, а снизу он имеет револьвер, в отверстия которого вставлено 3-4 обьектива. Вращая револьвер, можно установить любой обьектив под отверстие тубуса. Последний поднимается и опускается с помощью макро- и микрометрического винтов. Для грубого наведения изображения пользуются макровинтом. Более точно это делается с помощью микровинта. Микрометрический винт является одной из наиболее хрупких частей микроскопа и требует осторожного обращения с ним.

 

 

Предметный столик имеет круглую или прямоугольную форму. В его центре находится отверстие, над которым помещают предметное стекло с препаратом (мазком). В более совершенных микроскопах есть очень удобные предметные столики, которые с помощью специальных устройств перемещают предметное стекло в двух взаимо перпендикулярных направлениях.

Самой ценной частью микроскопа являются обьективы, которые состоят из нескольких линз в общей металлической оправе. Обьективы разделяются на сухие (х8, х40) и имерсионные (х90 х120). Сухими называют такие обьективы, между фронтальной линзой которых и предметным стеклом находится воздух. При этом, в связи с разницей показателей преломления стекла и воздуха (соответственно 1,52 и 1,0), часть световых лучей не попадает в глаз исследоавтеля. Имерсионными называют такие обьективы, между фронтальной линзой которых и исследуемым обьектом находится кедровое, персиковое масло или "имерсиол", коэффициент преломления света которых такой же, как и у стекла. При исследовании морфологии микроорганизмов пользуются преимущественно имерсионными обьективами, которые часто называют имерсионной системой.

Важнейшей характеристикой любого обьектива является его разрешающая способность. Это  наименьшее расстояние между двумя точками, при которой они еще видимы раздельно, то есть не сливаются в одну. Разрешающая способность обьектива ограничена такими явлениями, как хроматическая и сферическая аберрации, дифракция и др. Если оба вида аберрации можно устранить, то явление дифракции существует в любой оптической системе и его устранить или, хотя бы, уменьшить практически невозможно. Дифракция в значительной степени ограничивает разрешающую способность микроскопов.

Следовательно, при пользовании даже наилучшими имерсионными обьективами невозможно увидеть обьекты, которые имеют размеры меньше  0,2 мкм. Полезное увеличение обьектива не может превышать нумерическюу апертуру больше, чем в 1000 раз. Таким образом, максимальное полезное увеличение современных микроскопов при использовании имерсионных обьективов с апертурой 1,40-1,60 достигает 1400-1600.

Окуляр состоит из двух линз и только увеличивает изображение, которое выходит из обьектива, не добавляя к нему никаких деталей. Существуют окуляры с такими увеличениями: х7, х10, х15. Эти цифры обозначены на них.

Осветительный аппарат находится под предметным столиком и состоит из зеркала и конденсора с диафрагмой. Зеркало направляет пучок света в конденсор, а через него  в обьектив микроскопа. Одна сторона зеркала вогнутая, вторая  плоская. При микроскопировании с конденсором необходимо пользоваться лишь плоским зеркалом. Конденсор Аббеа состоит из системы линз для сбора пучка лучей в одной точке (фокус), которая находится в плоскости исследуемого препарата. При работе с дневным освещением конденсор нужно поднимать к уровню предметного столика, с искусственным  опускать до тех пор, пока изображение источника света не появится в плоскости, препарата. При исследовании неокрашенных препаратов конденсор также опускают.

Обьем света в соответствии с потребностями исследования регулируется диафрагмой, которая находится под конденсором. Она может сужаться и расширяться подобно зенице глаза (отсюда название ирис-диафрагма). Окрашенные препараты рассматривают при открытой, а неокрашенные  при суженой диафрагме.

Современные микроскопы имеют ряд усовершенствований, благодаря которым улучшается изображение и расширяются границы видимости. Первое достигнуто выпуском микроскопов-бинокуляров, второе исследованием в темном поле зрения. Бинокулярный микроскоп имеет специальную насадку с двумя тубусами (бинокулярная насадка). Это создает ряд преимуществ при микроскопировании. Исследуемый препарат рассматривают сразу обоими глазами, что не вызывает переутомления органа зрения. При этом одновременно достигается большая четкость глубины изображение и его пластичность.

С целью фундаментальных исследований морфологии микроорганизмов и других клеток оптическая промышленность выпускает более совершенные микроскопы. Одним из них является микроскоп универсальный биологический исследовательский МБД-15 . С его помощью можно проводить широкий обєм микроскопических исследований: визуальное наблюдение, использования светлого и темного полей зрения в прямом, косом и отраженном свете, метода фазовых контрастов, люминесцентной и интерференционной микроскопии. Для микрофотографирования исследуемых обьектов микроскоп оснащен фотоаппаратом с автоматическим затвором, фотоэкспонометром и импульсной лампой.

При изучении динамики развития и размножения микроорганизмов, действия на них разных физических и химических факторов, образования L-форм и других проблем изготовляют специальные микроскопы с микроустановками для цейтраферной (прерывистой) микрокиносъемки особенно с использованием метода фазовых контрастов.