80°С дистиллированной воды и медленно доводят до кипения на слабом огне. Затем воду

заменяют и кипятят еще 10 мин. Смену воды необходимо повторить 3-5 раз для полного удаления

остатков растворителя из фильтра. Отмытые фильтры можно хранить в дистиллированной воде

или в сухом виде. Непосредственно перед работой их повторно обрабатывают кипячением.

Мембраны "Владипор" также обрабатывают кипячением. Во избежание деформации

мембран на дно сосуда помещают нержавеющую сетку или "сторож для молока", чтобы не

допустить бурного кипения. Мембраны опускают в воду, нагретую до 80-90° С, и кипятят на

слабом огне 10-15 мин. Затем воду сливают и заменяют небольшим объемом стерильной

дистиллированной воды.

Другие виды фильтров готовят к исследованию согласно инструкции предприятия-

изготовителя.

Для фильтрации используют специальные фильтрационные установки: аппарат Зейтца,

прибор Гробара, аппарат Рублевской водопроводной станции и др. Установка состоит из патрона

для фильтра, емкости, в которую помещают исследуемый материал, приемного сосуда для

фильтрата и вакуумного насоса.

Перед работой патрон для фильтра и емкость для исследуемого материала стерилизуют

фламбированием после обтирания смоченным спиртом тампоном или другим подходящим

способом, либо кипятят. После охлаждения на сетку патрона с помощью фламбированного

пинцета помещают фильтр и прижимают его емкостью для исследуемого материала

В емкость для исследуемого материала при соблюдении правил стерильности наливают

необходимый объем пробы и создают вакуум в приемном сосуде. Объем фильтруемой жидкости

указан в НТД, регламентирующей исследование данного объекта. При отсутствии

соответствующих указаний следует выбирать такой объем жидкости, чтобы на фильтре выросло

не более 30 колоний искомой группы микроорганизмов.

Сразу после завершения фильтрации насос выключают, разбирают установку и

фламбированным пинцетом осторожно извлекают фильтр. Фильтр тем же пинцетом, не

переворачивая, помещают на питательную среду, поверхностью с осевшими на ней бактериями

вверх. При этом необходимо избегать образования пузырьков воздуха между средой и фильтром.

Па одну стандартную чашку можно поместить до 4 фильтров при условии, что они не будут

соприкасаться между собой.

Если исследуемый материал содержит большое количество взвешенных веществ,

фильтрацию проводят в 2 этапа: сначала через предварительный фильтр с размером пор 4 мкм

(можно использовать мембранный фильтр № 6 или мембрану МФА-МА № 10), а затем через

основной фильтр со средним диаметром пор не более 0,3 мкм. Для этого при сборке установки

предварительный фильтр укладывают поверх основного. По окончании фильтрации оба фильтра

переносят на питательную среду и в дальнейшем учитывают суммарное количество колоний,

выросших на двух фильтрах.

После фильтрации растворов с высоким осмотическим давлением или растворов веществ,

обладающих антимикробной активностью, фильтр необходимо промыть стерильной

дистиллированной водой или водно-солевым раствором.

Питательные среды с помещенными на их поверхность фильтрами, инкубируют в

благоприятных для выделения искомых микроорганизмов условиях. В последующем проводят

подсчет колоний с заданными свойствами, при необходимости - выделение чистой культуры и ее

идентификацию, а затем, с учетом профильтрованного объема, рассчитывают количество

бактерий в единице объема исследованной жидкости.

Мембранная фильтрация применяется в санитарной микробиологии очень широко. Она

может быть использована не только для определения концентрации микроорганизмов, но и для

контроля стерильности больших объемов жидкости.

Метод посева в жидкие среды (бродильный, титрационный метод)

Метод используется для определения количества жизнеспособных микроорганизмов в

жидких средах, широко применяется для определения индексов санитарно-показательных

микроорганизмов В начале готовят ряд разведении исследуемого материала, при этом шаг разведений в

принципе может быть любым, но в санитарной микробиологии чаще используют десятикратные

разведения. Затем проводят посев в жидкие питательные среды, при этом каждое разведение

можно высевать в I пробирку с жидкой средой - однорядный метод, в 2 - двухрядный метод, в 3 -

трехрядный и т. д. С увеличением количества рядов возрастает точность определения, однако, так

как увеличение числа рядов более 10 не ведет к существенному увеличению точности, их число

даже в научных исследованиях, как правило, не превышает 10. Для практических целей в

санитарной микробиологии чаще всего используют трехрядный метод. В каждую пробирку

засевают 1 мл разведения или кратный 10 (1, 10, 100 мл) объем исследуемого материала и после

инкубации учитывают количество пробирок с признаками роста микроорганизмов в каждом

разведении. При необходимости делают высев на плотную питательную среду и подтверждают

принадлежность бактерий к заданной группе или виду.

Для последующих расчетов выбирают три самые высокие последовательные разведения, в

которых встречаются как пробирки с ростом искомых микроорганизмов, так и без него. При этом

желательно, чтобы в наибольшем разведении тройки или в следующем за избранной тройкой

разведении рост микроорганизмов отсутствовал. Из числа положительных пробирок в каждом из

входящих в тройку разведении составляют формулу, согласно которой находят НВЧ (наиболее

вероятное число) по специальным таблицам

Посев микроорганизмов из воздуха. Наиболее простым способом определения общего количества микроорганизмов в воздухе является метод оседания микробов на агаровую пластинку, предложенный Р. Кохом. Метод заключается в том, что чашку Петри с мясопептонным   агаром    открывают  в  исследуемом  помещении на 5 мин, после чего закрывают крышкой, оборачивают бумагой, переворачивают вверх дном во избежание размыва колоний конденсационной водой, подписывают и помещают в термостат при 28-30 ºС для выращивания микробов, которые оседают на питательную среду вместе с пылью. По количеству выросших колоний можно судить о степени загрязненности воздуха микроорганизмами.

Количественный учёт микроорганизмов в воздухе. Р.Кох экспериментально установил, что за 5 мин на поверхность 100 см² оседает столько микроорганизмов, сколько их содержится в 10 л, или 0,01 м³ воздуха.

Рассчитывают, сколько микробов содержится в 1 м³ воздуха над открытой при посеве чашкой Петри с МПА.

Для этого:

1. Через 5-7 дней после посева подсчитывают число выросших в чашке колоний (n). Колония – это потомство одной микробной клетки на питательной среде.

2. Узнают площадь чашки Петри, для чего измеряют диаметр внутренней чашки со средой (5 см²) и рассчитывают по формуле:

S чашки Петри = π r² = 3,14´ 5² = 78,5 см².

3. Определяют число микроорганизмов в 1 м³ воздуха. Зная, сколько микробов выросло на площади 78,5 см², можно пересчитать, сколько их было бы на 100 см², а это, по методике Коха, соответствует их содержанию в 0,01 м³, значит в 1 м³ их должно быть в 100 раз больше. Рассчитывают число микроорганизмов в 1 м³  воздуха (x)  по формуле:           

Воздух считается загрязнённым, если в 1 м³ более 4,5 тыс. микроорганизмов.

Делают вывод о количестве микробов в помещении, где проводился анализ микрофлоры воздуха.

Определение качественного состава микрофлоры воздуха. Под качественным анализом микрофлоры понимается описание культуральных и морфологических признаков микроорганизмов, что служит основой для определения их видовой принадлежности.

Культуральные признаки – это внешний вид колоний при выращивании на различных питательных средах. К культуральным признакам колонии относятся:

1) размер – крупные (диаметр 4-6 мм и более), средние (2-4 мм), мелкие (1-2 мм) и точечные (не более 1 мм) колонии;

2) форма – круглая, овальная, неправильная, амёбовидная, ветвистая, ризоидная и др.;

3)  цвет – белый, розовый, жёлтый, оранжевый, красный и др.;

4) профиль или рельеф – плоский, выпуклый, кратеровидный, конусовидный, изогнутый и др.;

5) поверхность – блестящая, матовая, морщинистая, гладкая и др.;

6) консистенция – жидкая, вязкая, пастообразная, сухая, плотная и др. (устанавливается прикосновением к поверхности колонии бактериологической петлей);

7) край – ровный, волнистый, лопастной, бахромчатый и др. (рассматривают, пользуясь лупой или под микроскопом).

 К морфологическим признакам микробов относятся форма, характер деления и размер клеток, особенности спорообразования и жгутикования,  наличие капсулы, включений, окраска по Граму и др.

Для описания морфологических признаков из доминирующих колоний готовят препараты-мазки – петлей берут немного микробного материала и тщательно размазывают по стеклу, фиксируют в пламени, окрашивают кристаллвиолетом 30-60 с и рассматривают, пользуясь иммерсионной системой микроскопа. Отмечают форму клеток, наличие или отсутствие спор, капсул и зарисовывают в тетради. Делают выводы о преобладающих формах микроорганизмов в воздухе.