19. Рост и размножение

Термин «рост» означает увеличение цитоплазматической массы отдельной клетки или группы бактерий в результате синтеза клеточного материала (например, белка, РНК, ДНК). Достигнув определенных размеров, клетка прекращает рост и начинает размножаться.

Под размножением микробов подразумевают способность их к самовоспроизведению, увеличению количества особей на единицу объема. Иначе можно сказать: размножение — это повышение числа особей микробной популяции.

Бактерии размножаются преимущественно простым поперечным делением (вегетативное размножение), которое происходит в различных плоскостях, с образованием многообразных сочетаний клеток (кисть винограда — стафилококки, цепочки — стрептококки, соединения по парам — диплококки, тюки, пакеты — сарцины и др.). Процесс деления состоит из ряда последовательных этапов. Первый этап начинается формированием в средней части клетки поперечной перегородки (рис. 6), состоящей вначале из цитоплазматической мембраны, которая делит цитоплазму материнской клетки на две дочерние. Параллельно с этим синтезируется клеточная стенка, образующая полноценную перегородку между двумя дочерними. В процессе деления бактерий важным условием является репликация (удвоение) ДНК, которая осуществляется ферментами ДНК-полимеразами. При удвоении ДНК происходит разрыв водородных связей и образование двух спиралей ДНК, каждая из которых находится в дочерних клетках. Далее дочерние односпиральные ДНК восстанавливают водородные связи и вновь образуют двуспиральные ДНК.

Репликация ДНК и деление клеток происходит с определенной скоростью, присущей каждому виду микроба, что зависит от возраста культуры и характера питательной среды. Например, скорость роста кишечной палочки колеблется от 16 до 20 мин; у микобактерий туберкулеза деление наступает лишь через 18—20 ч; для клетки культуры тканей млекопитающих требуются сутки. Следовательно, бактерии большинства видов размножаются почти в 100 раз быстрее, чем клетки культуры тканей.

Типы деления клеток бактерий. 1. Клеточное деление опережает разделение, что приводит к образованию «многоклеточных» палочек и кокков. 2. Синхронное клеточное деление, при котором разделение и деление нуклеоида сопровождаются образованием одноклеточных организмов. 3. Деление нуклеоида опережает клеточное деление, обусловливая образование многонуклеоидных бактерий.

Разделение бактерий, в свою очередь, происходит тремя способами: 1) разламывающее разделение, когда две индивидуальные клетки, неоднократно переламываясь в месте сочленения, разрывают цитоплазматический мостик и отталкиваются друг от друга, при этом образуются цепочки (сибиреязвенные бациллы); 2) скользящее разделение, при котором после деления клетки обособляются и одна из них скользит по поверхности другой (отдельные формы эшерихий); 3) секущее разделение, когда одна из разделившихся клеток свободным концом описывают дугу круга, центром которого является точка ее контакта с другой клеткой, образуя римскую пятерку или клинопись (коринебактерии дифтерии, л истерии).

Фазы развития бактериальной популяции. Теоретически допускается, что если бактериям создать условия непрерывного притока и прогрессивного увеличения массы свежей питательной среды и оттока продуктов выделения, то размножение будет возрастать логарифмически, а гибель арифметически.

Общую закономерность роста и размножения бактериальной популяции принято показывать графически в виде кривой, которая отражает зависимость логарифма числа живых клеток от времени. Типичная кривая роста имеет S-образную форму и позволяет различать несколько фаз роста, сменяющих друг друга в определенной последовательности:

1. Исходная (стационарная, латентная, или фаза покоя). Представляет собой время от момента посева бактерий на питательную среду до их роста. В этой фазе число живых бактерий не увеличивается, а может даже уменьшаться. Продолжительность исходной фазы 1—2 ч.

2. Фаза задержки размножения. В течение этой фазы бактериальные клетки интенсивно растут, но слабо размножаются. Период этой фазы занимает около 2 ч и зависит от ряда условий: возраста культуры (молодые культуры приспосабливаются быстрее, чем старые); биологических особенностей микробных клеток (для бактерии кишечной группы характерен короткий период приспособления, для микобактерий туберкулеза — длительный); полноценности питательной среды, температуры выращивания, концентрации СО2, рН, степени аэрации среды, оксилительно-восстановительного потенциала и др. Нередко обе фазы объединяют термином «лаг-фаза» (англ. lag — отставание, запаздывание).

3. Логарифмическая фаза. В этой фазе скорость размножения клеток и увеличение бактериальной популяции максимальны. Период генерации (лат. generatio — рождение, воспроизведение), т. е. время, прошедшее между двумя последовательными делениями бактерий, в этой стадии будет постоянным для данного вида, а количество бактерий станет удваиваться в геометрической прогрессии. Это означает, что в конце первой генерации из одной клетки формируются две, в конце второй генерации обе бактерии, разделяясь, образуют четыре, из полученных четырех формируются восемь и т. д. Следовательно, после n генераций количество клеток в культуре будет равно 2n. Длительность логарифмической фазы составляет 5—6 ч.

4. Фаза отрицательного ускорения. Скорость размножения бактерий перестает быть максимальной, число делящихся особей уменьшается, а число погибших увеличивается (длительность около 2 ч). Одна из возможных причин, замедляющих размножение бактерий, — истощение питательной среды, т. е. исчезновение из нее веществ, специфических для данного бактериального вида.

5. Стационарная фаза максимума. В ней число новых бактерий почти равно числу отмерших, т. е. наступает равновесие между погибшими клетками и вновь образующимися. Продолжается эта фаза 2 ч.

6. Фаза ускорения гибели. Характеризуется прогрессивным превосходством числа погибших клеток над количеством вновь нарождающихся. Длится она около 3 ч.

7. Фаза логарифмической гибели. Отмирание клеток происходит с постоянной скоростью (длительность около 5 ч).

8. Фаза уменьшения скорости отмирания. Остающиеся в живых клетки переходят в состояние покоя.

20. При периодическом способе культивирования популяция микроорганизмов проходит 7 стадий (фаз) роста 1. Лагфаза. В этот период культура адаптируется к новой среде обитания. Активизируются ферментные системы, возрастает количество нуклеиновых кислот, клетка готовится к интенсивному синтезу белков и других соединений. Клетки не размножаются (скорость размножения равна нулю). Концентрация живых клеток постоянна и равна количеству внесенных клеток. Продолжительность этой фазы зависит от физиологических особенностей микроорганизма и от состава питательной среды.

2. Фаза ускорения роста. Эта фаза характеризуется началом деления клеток, увеличением общей массы и постоянным увеличением скорости роста культуры. Эта фаза обычно непродолжительна.

3. Экспоненциальная (логарифмическая) фаза роста. В этот период микроорганизмы размножаются с постоянной максимальной скоростью. При этом логарифм числа клеток линейно зависит от времени. К концу этой фазы среда истощается вследствие катаболических и анаболических процессов, в среде накапливаются продукты жизнедеятельности микроорганизмов. Возникает и пространственная ограниченность, так как клетки мешают друг другу.

4. Фаза замедления роста. В этот период снижается скорость роста, небольшая часть клеток гибнет. Скорость роста выше скорости отмирания.

5. Стационарная фаза. Количество живых клеток достигает максимума. Скорость роста равна скорости отмирания клеток, поэтому концентрация жизнеспособных клеток остается постоянной.

6. Фаза ускорения отмирания. Количество отмерших клеток (скорость отмирания) становится больше количества образовавшихся клеток.

7. Фаза отмирания. Масса живых клеток значительно уменьшается, так как в среде нет питательных веществ, а запасные вещества клетки исчерпываются.

При непрерывном способе культивирования культура поддерживается в какой-то фазе роста.

Если цель культивирования – получение биомассы продуцента, процесс целесообразно вести в режиме логарифмической фазы, когда микроорганизм способен обеспечить максимальную скорость роста популяции.

Для поддержания культуры в логарифмической фазе культивирование микробной популяции проводят в условиях хемостата или турбидостата.

Рост в хемостате. Хемостат состоит из сосуда, в который вводят с постоянной скоростью питательный раствор. По мере поступления питательного раствора из него вытекает суспензия микроорганизмов с той же скоростью. При культивировании в условиях хемостата поддерживается постоянная концентрация одного из компонентов среды (например, углерода). Благодаря этому в условиях хемостата поддерживается постоянная скорость роста культуры. Культура микроорганизма находится в условиях динамического равновесия.

Рост в турбидостате. Работа турбидостата основана на поддержании постоянной концентрации живых клеток. В сосуде для культивирования все питательные вещества содержатся в избытке, а скорость роста бактерий приближается к максимальной.

Если же целью культивирования является получение метаболтта (например, этилового спирта), выход которого в среду обитания не соответствует логарифмической фазе роста, применяется способ непрерывного выращивания в двух или нескольких последовательно соединенных аппаратах, что позволяет как бы расчленить процесс на несколько стадий.

21. Накопительные культуры. Метод накопительных культур и в прин­ципе, и на практике очень прост. Для накопления нужны такие условия, при которых данный организм преодолевает конкуренцию остальных. Подбирая ряд факторов (источники энергии, углерода, азота, акцепторы электронов, газовую атмосферу, освещенность, температуру, рН и т.д.), создают определенные условия и инокулируют среду смешанной попу­ляцией, какая имеется, например, в почве или в иле. Наиболее приспособленный к такой среде микроорганизм растет и вытесняет все остальные, сопутствующие организмы. Путем многократных пересевов в такую же жидкую среду и посева на твердую среду того же состава можно без труда выделить преобладающий (накопленный) штамм. Частый пересев с жидкой среды на жидкую предотвращает рост сопут­ствующих организмов, которые могли бы использовать продукты выде­ления или даже автолиза клеток первичной культуры. Лучшим материалом для инокуляции служат пробы из тех мест, где уже имеется «естественное обогащение». Можно, например, выделять микроорга­низмы, использующие окись углерода, из сточных вод газовых заводов; использующие гемоглобин-из сточных вод боен, а те, которые окис­ляют углеводороды,-из почвы на нефтепромыслах или из нефтяных отстойников.

Элективные культуры, клетки микроорганизмов, выращенные на избирательных (элективных) питательных средах. Предложены русским микробиологом С. Н. Виноградским. Благодаря специально подобранному составу элективных сред создаются условия, благоприятные для преимущественного роста микроорганизмов с определёнными физиологическими свойствами. Например, при посеве почвы, воды или грунта водоёмов в питательную среду, в состав которой входят глюкоза и ряд минеральных солей, но отсутствуют соединения, содержащие азот, на ней начинают расти азотфиксирующие микроорганизмы. Э. к. бактерий, разлагающих целлюлозу, получают на питательной среде, содержащей в качестве единственного источника углерода целлюлозу. Выделению чистых культур этих микробов всегда предшествует получение их Э. к. В присутствии факторов роста (витаминов, аминокислот и др.) Э. к. могут быть получены при внесении в питательную среду меньшего количества клеток бактерий, что позволяет обнаруживать в почве и воде в 4—10 раз больше микробов, чем при посевах на среды без факторов роста.